蒙古口蘑菌種培養基的篩選研究

徐偉良李春冬隋業璇李林瑛李鳳忠郭梁

(1.錫林郭勒職業學院生物工程研究院，內蒙古 錫林郭勒 026000；2.錫林郭勒盟坤源生物科技有限公司，內蒙古 錫林郭勒 026000)

蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum Imai.)，又名蒙古白麗蘑。1937年由日本學者今井三子(S.Imai)定名發表，2011年姚一建等通過系統發育學研究，將其又重新劃分并組建為白麗蘑新屬(Leucocalocybe)，因此蒙古口蘑又被稱作蒙古白麗蘑(Leucocalocybemongolica(S.Imai)X.D.Yu&YJ.Yao)，現屬口蘑科(Tricholomataceae)白麗蘑屬(Leucocalocybe)[1，2]。隨著氣候的變化、草原的退化以及人為破壞性采摘等因素的影響，2021年，蒙古口蘑被列入《國家重點保護野生植物名錄》，成為二級瀕危保護物種。野生蒙古口蘑種群數量的減少甚至瀕危亟需科學的研究保護，據報道蒙古口蘑現只分布在呼倫貝爾市以及錫林郭勒盟等旗縣地區。

目前，蒙古口蘑相關研究僅停留在遺傳多樣性[3]、菌種發酵[4]、生物活性成分(多糖、蛋白質、多肽、甾體等)[5-7]等方面。現階段，蒙古口蘑的人工栽培和馴化也處于實驗室研究階段，唯一成功的報道是在20世紀90年代，田紹義等[8]報道以麥秸、棉籽皮為原料馴化栽培出蒙古口蘑。食用菌液體培養相比傳統固體培養基具有培養周期短、菌種生長均勻、生產成本低、易于調控、便于接種、減少污染等優點，因此有學者對蒙古口蘑的液體進行了研究。吳曉彤[9]經過研究確定蒙古口蘑在搖瓶發酵時的最佳培養條件為接種量12%，溫度25℃，轉速150r·min-1。

本研究通過蒙古口蘑野生子實體的分離、鑒定、培養獲得口蘑菌種資源，選取不同種類的固體、液體、栽培種培養基進行篩選研究，為后續蒙古口蘑的人工馴化提供優質菌種，以期通過科學手段保護和開發錫林郭勒蒙古口蘑資源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

蒙古口蘑子實體采自于錫林郭勒盟草原；青干草、牛糞、木屑購自于錫林浩特市牧民家；馬鈴薯、小麥、玉米粉等購自于錫林浩特市農貿市場。

1.1.2 試劑

EasyTaq PCR Super Mix，北京全式金生物技術有限公司；ITS引物合成，北京睿博興科生物科技有限公司；維生素B1、酵母浸膏、蛋白胨、瓊脂(生化試劑)及其余分析純試劑均購自國藥集團。

1.1.3 培養基

固體培養基參考本研究團隊郭梁等研究[10，11]，選取馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar，PDA)、PDA加富培養基及改良PDA培養基3種作為篩選培養配方。

液體培養基參考本研究團隊隋業璇等研究[12，13]報道的4種液體培養基配方。

栽培種培養基配方3種，參考許修宏研究方法[14]。栽培種培養基1：玉米1.0kg，石膏50.0g，麩皮50.0g，木屑200.0g，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，蒸餾水根據濕度添加；栽培種培養基2：小麥1.0kg，石膏50.0g，麩皮50.0g，牛糞120.0g，青干草120.0g，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，蒸餾水根據濕度添加；栽培種培養基3：高粱1.0kg，石膏50.0g，麩皮50.0g，木屑200g，KH2PO42.0g，MgSO41.0g，蒸餾水根據濕度添加。

1.2 儀器與設備

YC-R50恒溫培養搖床和202-3A電熱恒溫培養箱，賽默飛世爾科技公司；2720 Thermal Cycler PCR擴增儀，美國BIO-RAD公司；SW-J-2FD超凈工作臺，蘇州博萊爾凈化設備有限公司；MLS-3751L-PC高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 蒙古口蘑子實體與菌絲體分子鑒定

分別取蒙古口蘑子實體和菌絲體樣品進行DNA鑒定。將蒙古口蘑子實體樣品清洗消毒，用鑷子取菌蓋內部的子實體樣品50mg放入1.5mL試管中，用剪刀攪碎后備用；菌絲體樣品是先將菌絲球用紗布過濾，用無菌水清洗后，稱取50mg濕重樣品放入1.5mL試管中搗碎作為DNA提取樣品。使用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒進行DNA提取，選用通用引物ITS1和ITS4進行擴增。PCR反應條件：95℃預變性5min；95℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共34循環；72℃加強延伸10min。將獲得的擴增產物進行測序，測序結果經NCBI數據庫進行BLAST同源比對。

1.3.2 菌絲體固體培養基的篩選

選取生長良好的蒙古口蘑子實體，按照無菌操作對蒙古口蘑子實體縱剖，在蒙古口蘑子實體上劃不同的4個位置用接種鉤勾取3mm×3mm×3mm大的塊狀組織，放置在PDA培養基中，在25℃恒溫培養箱中初步培養。用打孔器在初步培養后的培養基上取生長速度和大小相同的菌絲塊放在3種不同的固體培養基中進行培養，觀察并每日記錄，直至菌絲長至培養皿邊緣。用電子萬用爐加熱溶解3種固體培養基培養，使瓊脂溶解在培養基內，用無菌紗布進行過濾。將菌絲放在預先稱量好的培養皿中，放置于80℃狀態下烘干，取出后冷卻至恒重再稱量。

1.3.3 菌絲體液體培養基的篩選

在篩選出的固體培養基上，選取菌絲長勢相似位置，用打孔器選取16個直徑均為1cm的菌塊，4個為1組，分別接種于100mL 4種不同液體培養基中，并放入25℃恒溫搖床培養箱中培養5d。隨機取10個培養好的菌絲球排成直線，測量其長度，然后除以10即為菌絲球的平均直徑，重復3次，取平均值。再將菌絲球放在紗布上過濾，用無菌水清洗后，于80℃下烘干4h，冷卻至室溫稱重，利用公式計算菌絲體生物量[11]。計算公式：

菌絲體生物量(g·L-1)=菌絲體干重/培養液體積

(1)

1.3.4 菌絲體栽培種培養基的篩選

挑選當年收獲的無蟲蛀、無霉變的小麥、玉米、高粱，清洗去除灰塵雜質，并按栽培種培養基配方進行混料，在121℃高溫高壓滅菌鍋中，滅菌120min，待冷卻后放入超凈工作臺中備用。在無菌環境操作下，將篩選出的最優液體培養基B按照培養基重量的3%分別接種在以玉米、麥粒、高粱為主料的3種栽培種培養基中，并置于25℃的恒溫箱中培養。觀察并記錄菌絲吃料深度，根據率先長滿栽培瓶的時間和菌絲吃料深度篩選出最優栽培種培養基的配方。

2 結果與分析

2.1 子實體與菌絲體的分子鑒定

將采集得到的蒙古口蘑子實體和菌絲體分別進行DNA提取，進行PCR擴增和凝膠電泳驗證。由圖1可知，蒙古口蘑的DNA擴增產物條帶在600bp左右，經DNA測序后進行NCBI序列比對表明，與數據庫中蒙古口蘑基因序列相似性為100%，確定子實體與分離得到的菌絲體均為蒙古口蘑。

圖1 蒙古口蘑分子鑒定

2.2 蒙古口蘑菌種固體培養基的篩選結果

利用選取的3種固體培養基對蒙古口蘑菌種進行篩選培養，連續觀測32d記錄菌絲的生長狀況，以菌絲干質量和菌絲長度為評價指標，通過統計分析篩選出最適蒙古口蘑菌種生長的固體培養基配方，結果見圖2～4。通過觀察測量菌絲長度發現，在3種培養基上菌絲長勢呈現先快后慢的現象。菌絲在培養至第32天時，PDA培養基與PDA加富培養基上的菌絲率先長至培養皿邊緣，而改良PDA培養基上菌絲生長略慢，也已接近培養皿邊緣，但整體生長速度無顯著差異。通過菌絲干質量比較，改良PDA培養基上的菌絲干質量最大為0.19±0.03g，而PDA培養基與PDA加富培養基上的菌絲干質量分別為0.1±0.01g和0.11±0.003g，綜上實驗數據分析，說明改良PDA培養基上的菌絲干質量積累較多，確定改良PDA培養基為蒙古口蘑菌種的最優固體培養基配方。馬榮山等[11]對蒙古口蘑菌蓋、菌柄、菌褶以及菌蓋和菌柄交界處，取采用組織分離法分離菌絲體進行分離培養，結果表明在菌絲萌發后30～36d后，4種組織分離的菌絲均長滿試管，萌發率約為35%。本研究采用與馬榮山相近的固體培養基配方的基礎上進行改良，最終改良PDA培養基上蒙古口蘑菌絲的長勢和所需生長時間與其基本相近。

圖3 蒙古口蘑菌種在3種固體培養基上的菌絲長度

2.3 蒙古口蘑菌種液體培養基的篩選結果

選用常見的4種液體培養基進行菌種培養，結果見圖5，并以菌絲體生物量(折線圖)和菌絲球平均長度(柱狀圖)為評價指標，對蒙古口蘑最佳液體培養基進行篩選，結果見圖6。由圖6可知，蒙古口蘑菌種在液體培養基A、B、C、D上的菌絲生物量分別為3.71±0.15g·L-1、6.19±0.12g·L-1、4.01±0.10g·L-1、2.33±0.11g·L-1，其中液體培養基B上菌絲生物量最大；4種液體培養基中菌絲球平均長度分別為4.5±0.3cm、4.77±0.35cm、3.73±0.15cm、2.7±0.1cm，在液體培養基B上的菌絲球平均長度最高。通過菌絲體生物量及菌絲球平均長度的比較分析，最終確定液體培養基B為蒙古口蘑菌種的最佳培養基配方。其他學者也對蒙古口蘑液體發酵進行了深入研究。渠志臻[13]通過優化接種量、裝液量、搖床轉速等蒙古口蘑液體搖瓶培養參數，最終測得培養13d后，菌絲體生物量增長到10.6g·L-1。張娟等[15]對巴音布魯克草原上分布的野生蒙古口蘑液體培養基的天然營養物質和培養條件進行優化，培養10～15d后，其菌絲生物量可達6.848g·L-1。本研究初步篩選的液體培養基配方B，接種量遠小于以上研究報道，并在培養5d后，其生物量就與張娟等研究報道的生物量相近，可見本研究篩選的液體培養基B相較具有一定優勢。

2.4 蒙古口蘑菌種栽培種培養基的篩選結果

選用3種栽培種培養基對蒙古口蘑菌種進行培養，觀察記錄菌絲在栽培種培養基上的生長狀態，結果見圖7，并通過菌絲平均吃料深度篩選出最適合該種蒙古口蘑菌種生長的栽培種培養基配方，結果見圖8。經過10d的栽培培養，以玉米為主料的栽培種培養基平均吃料深度為10.2±0.53cm；以高粱為主料的栽培種培養基平均吃料深度為11.36±0.72cm，并率先長滿栽培瓶；以小麥為主料的栽培種培養基平均吃料深度為8.66±0.26cm。綜合以上實驗數據顯示，以高粱為主料的栽培種培養基吃料深度最深，且菌絲茂密，生長狀態良好，由此確定高粱為主料是蒙古口蘑菌種的最優栽培種培養基配方。魯鐵[3]對玉米粒、麥粒、大米、羊草、發酵羊草5種基質進行了蒙古口蘑固態發酵的最佳基質的篩選，最終以滿瓶生長時間(32d)和成本確定玉米粒為較優良的固態發酵基質。本研究以率先長滿栽培瓶的時間和菌絲吃料深度完善了篩選評價條件，并且菌絲生長時間和長勢明顯優于魯鐵研究報道的玉米粒固態發酵基質。

圖6 4種液體培養基上的菌絲體生物量和菌絲球平均長度

圖7 蒙古口蘑菌種在3種栽培種培養基中的生長狀態

圖8 蒙古口蘑菌種在3種栽培種培養基中的吃料深度

3 結論

本文通過菌種分子鑒定、固體培養基、液體培養基、栽培種培養基的篩選研究確定改良PDA培養基為蒙古口蘑菌種的最佳固體培養基配方，在培養32d后，菌絲干質量達0.19±0.03g；確定液體培養基B為蒙古口蘑菌種的最佳液體培養基配方，在培養5d后，菌絲體生物量與菌絲生長長度分別為6.19g·L-1、2.7±0.1cm；確定以高粱為主料的栽培種培養基為蒙古口蘑菌種的最佳栽培種培養基配方，培養10d后，其菌絲吃料深度為11.36±0.72cm。本研究最終選用固體、液體、栽培種3種培養基成分來源廣泛、配制方便、價格便宜，通過對蒙古口蘑菌種進行改良，適用于大規模的推廣和應用。以3種培養基培養的優質菌種為進一步保護和開發錫林郭勒草原白蘑提供科學基礎。