羥基法舒地爾對實驗性自身免疫性腦脊髓炎小鼠氧化應激的影響①

褚果果 王 婧 鞠文媛 陳陽陽 李曉慧 張海飛 宋麗娟 黃建軍 王 青 肖保國馬存根（山西醫科大學第一醫院神經內科/細胞生理學教育部重點實驗室，太原 030001）

多發性硬化（multiple sclerosis，MS）是一種由自身免疫功能紊亂引起多灶性和散在性軸突和神經元損傷的中樞神經系統（central nervous system，CNS）疾病，也是導致年輕人殘疾的常見病之一［1］。作為一種慢性炎癥性、脫髓鞘性、神經變性疾病，MS的具體病因仍不清楚，但多項研究表明，CNS內氧化應激可導致神經組織多種損傷，如炎癥、髓鞘破壞和軸突變性，是導致MS 發生、進展和臨床癥狀的重要因素。因此，近年來應用多種抗氧化劑改善MS，如輔酶Q10、褪黑素和維生素C等［2］。

實驗性自身免疫性腦脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是MS的經典動物模型。法舒地爾是最早獲批主要用于改善腦血流異常的ROCK抑制劑，但其具有抗氧化作用，可明顯減輕EAE 的臨床癥狀［3-6］。然而，法舒地爾在臨床實踐中存在安全窗窄、半衰期短等缺點，限制了其治療慢性疾病的長期應用。作為法舒地爾的代謝產物，羥基法舒地爾（Hydroxyfasudil，HF）也被發現對ROCK 具有選擇性抑制作用，且其生物學活性更高，半衰期更長，然而目前關于HF 治療EAE 的研究較少［7］。HF 是否可以通過抑制氧化應激發揮對EAE小鼠的治療作用值得探討。因此，本實驗擬通過觀察HF 對EAE 小鼠的治療效果及其對氧化應激的影響，探究可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與動物 BV2 小膠質細胞系由中國科學院上海分院細胞庫提供；16只8～10 周齡清潔級健康C57BL/6 小鼠，體質量17～22 g，購于北京維通利華實驗動物有限公司。適應性飼養，飼養環境：22～25 ℃，自由進食和飲水，保持12 h/12 h 明暗交替。飼養1周后開展實驗。本實驗已通過山西中醫藥大學醫學倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑與儀器 羥基法舒地爾（美國MedChemExpress 公司）；MOG35-55肽段（中國西安聯美生物科技有限公司）；滅活結核分枝桿菌H37Ra（mycobacterium tuberculosis，TB，美國BD公司）；百日咳毒素（pertussis toxin，PTX，美國Enzo Life Sciences公司）；完全弗氏佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA，美國Sigma 公司）；MTT 細胞活力檢測試劑盒、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）、牢固藍（luxol fast blue，LFB）染色液、HE 染色試劑盒、DPPH、ABTS 自由基清除檢測試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）；活性氧（reactive oxygen，ROS）、活性氮（reactive nitrogen species，RNS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）ELISA 試劑盒（中國泛柯實業有限公司）；核因子E2 相關因子2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）抗體（美國Cell Signaling Technology 公司）；血紅素加氧酶-1（heme oxygenase 1，HO-1）抗體（中國愛必信生物科技有限公司）；anti-β-actin（美國Bioworld 公司）。冰凍切片機、顯微鏡（德國Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組及給藥 BV2 細胞鋪于96 孔板，貼壁后加入不同濃度的HF 孵育24 h。BV2 細胞隨機分為正常對照組、LPS組和LPS+HF 組。HF（15 μg/ml）預處理2 h 后給予LPS（1 μg/ml）刺激24 h。小鼠根據體質量隨機分為EAE 組和HF 組，分籠飼養，每組8 只。每只小鼠于腰背部分兩點皮下注射CFA 乳化劑，由MOG35-553.2 mg 和TB 64 μg 充分混懸配制，注射劑量為100 μl/只。于免疫后當天和48 h 后腹腔注射PTX，劑量為300 ng/只。HF 組小鼠于免疫后第3 天起腹腔注射HF 干預，劑量為40 mg/（kg·d），EAE組小鼠注射等量生理鹽水。

1.2.2 癥狀評估 從第0 天起由至少兩名觀察者隔天對小鼠癥狀進行觀察并評分。5 分法評分標準：無臨床癥狀，不發病計0分；尾部柔軟，張力部分喪失計1分；后肢無力或共濟失調，左右搖晃步態計2 分；雙側后肢完全癱瘓計3 分；雙后肢及尾部癱瘓伴前肢力弱計4分；精神萎靡，四肢癱瘓或瀕死狀態計5 分。若癥狀介于兩者之間，則記錄中間分數（±0.5分）。

1.2.3 組織制備 每組取4只小鼠，生理鹽水經心尖處灌注后，固定，然后迅速剝離脊髓組織，10%、20%、30%蔗糖溶液梯度脫水，將腰膨大段用OCT膠包埋，冰凍切片機切片，用于染色。每組剩余小鼠剝離的脊髓組織勻漿提取蛋白用于Western blot檢測。

1.2.4 MTT 檢測細胞活力 每孔加入10 μl MTT溶液，繼續培養4 h，棄去上清液加入100 μl DMSO，振蕩10 min后于490 nm處測量吸光度（OD）值。

1.2.5 DPPH、ABTS自由基清除實驗

1.2.5.1 DPPH 實驗 將空白提取液、陽性標準品溶液和不同濃度的HF 溶液各10 μl 加入190 μl DPPH 工作液中，避光室溫靜置30 min，于515 nm 處檢測OD值。清除率（%）=（A空白-A測定）/A空白×100%。

1.2.5.2 ABTS實驗 空白組：將24 μl蒸餾水加至180 μl ABTS 混合液中，測定組和陽性對照組（positive contral，PC）：將陽性標準品溶液和不同濃度的HF 溶液各6 μl 加至180 μl ABTS 混合液和18 μl 蒸餾水中反應10 min，于593 nm 處測定OD 值。清除率（%）=（A空白-A測定）/A空白×100%。

1.2.6 HE染色 脊髓切片復溫，蘇木素染色10 min，快速沖洗2 次，每次2 min，水洗后分化15 s，自來水沖洗，伊紅染色1.5 min，蒸餾水清洗5 min，快速脫水，透明，封片，觀察。

1.2.7 LFB 染色 脊髓冰凍切片復溫，60 ℃浸泡于LFB 染液中20 h，95%乙醇浸泡10 min 去除多余染液，分化液分化15 s，70%乙醇分色30 s，至灰白質清晰，蒸餾水沖洗，脫水，透明，封片，觀察。

1.2.8 氧化抗氧化指標ROS、RNS、MDA、SOD、CAT 和GSH-Px 的檢測 將BV2 細胞上清液和小鼠脊髓勻漿于5 000 r/min 離心10 min。取包被好的96 孔板，每個樣品設置3 個復孔，分別將10 μl 上清液或小鼠脊髓勻漿加入孔中，然后每孔中再加入40 μl樣品稀釋液和100 μl酶標二抗溶液，37 ℃靜置1 h，清洗3～5 次后，每孔各加入50 μl A、B 顯色液，避光靜置10 min，每孔加入50 μl 終止液，即刻使用酶標儀于450 nm處檢測各孔OD值。

1.2.9 免疫熒光染色 脊髓切片恢復至室溫，PBS中浸泡除去OCT 膠，1%BSA 封閉30 min 后，分別加Nrf2（1∶300）和HO-1（1∶200）抗體稀釋液，4 ℃孵育過夜，洗去一抗，加入二抗稀釋液孵育2 h，洗去抗體，封片，觀察。

1.2.10 Western blot 檢測 取各組小鼠脊髓蛋白樣品，100 ℃加熱10 min。每條泳道加入30 μg 蛋白，于10%聚丙烯酰胺凝膠上恒壓（120 V）電泳分離蛋白，然后濕轉至PVDF 膜。將膜浸泡于5%脫脂牛奶中1 h，TBST 洗滌3～5 次后，加入Nrf2 一抗（1∶1 000）、HO-1 一抗及內參β-actin 一抗（1∶5 000），4 ℃孵育過夜，次日經TBST 充分洗滌后，加入HRP標記的二抗（1∶5 000）室溫靜置2 h，TBST 洗滌3～5 次，每次5 min。化學發光法顯影曝光，觀察拍照，以Nrf2、HO-1條帶灰度值與內參β-actin灰度值的比值表示蛋白相對表達量。

1.3 統計學分析 計量數據的統計分析采用GraphPad Prism8.0 進行，各項實驗指標均以表示。多組均數間比較采用單因素方差分析，兩組均數采用t檢驗進行比較。當P<0.05時認為差異有統計意義。

2 結果

2.1 HF 在體外對自由基的清除作用 與PC 組［（95.33±2.52）%、（95.00±2.00）%］相比，HF 在體外對DPPH 和ABTS自由基幾乎沒有清除作用，且在3.75～60 μg/ml 的濃度范圍內自由基清除率無明顯差異。見圖1。

圖1 不同濃度HF對自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of different concentrations of HF on free radicals

2.2 HF 對BV2 細胞活力的影響 當HF 在低濃度范圍內（3.75、7.5、15 μg/ml），細胞活力與對照組（0 μg/ml）間差異無統計學意義，不同濃度組間細胞活力差異也無統計學意義。當HF 濃度達到較高濃度（30、60 μg/ml）時，細胞活力顯著下降（P<0.05）。根據MTT 結果，后續的體外細胞實驗采用對細胞活力沒有影響的15 μg/ml HF。見圖2。

圖2 不同濃度HF對BV2細胞活性的影響Fig.2 Effects of different concentrations of HF on viability of BV2 cells

2.3 HF對BV2細胞氧化應激的影響 與LPS組相比，經HF 干預后BV2 小膠質細胞中氧化產物ROS、RNS 和MDA 產生均減少（P<0.05），抗氧化酶SOD和GSH-Px 含量顯著增加（P<0.05），而CAT 含量在兩組間差異無統計學意義（P>0.05）。見圖3。

圖3 HF對BV2細胞氧化應激的影響Fig.3 Effects of HF on oxidative stress in BV2 cells

2.4 HF 抑制EAE 小鼠的臨床癥狀 自免疫后第11 天開始，EAE 組小鼠尾部遠端張力減弱，出現下垂，且隨免疫時間延長逐漸加重，平均發病時間為免疫后（16.34±4.98）d，臨床評分的平均最高分值為（3.84±1.09）。HF 組小鼠并未出現任何臨床癥狀，EAE 組小鼠臨床評分持續上升。免疫后第16～28天，EAE組小鼠癥狀普遍較為嚴重，臨床評分與HF 組相比開始出現統計學差異（P<0.05）。見圖4。

圖4 EAE組和HF組小鼠臨床評分變化Fig.4 Differences in clinical scores between EAE group and HF group mice

2.5 HF抑制脊髓炎癥、改善髓鞘脫失 HE染色結果表明，EAE 組小鼠脊髓白質內有大量炎癥細胞浸潤，HF 組炎癥細胞浸潤明顯減少（P<0.05）。根據LFB 對髓鞘染色的結果分析，EAE 組小鼠脊髓白質內可見大量未著色的空泡，說明白質內髓鞘脫失嚴重，而HF 組脊髓白質染色均一致密，未見明顯脫失（P<0.05），與臨床評分表現一致。見圖5。

圖5 HF 對EAE 小鼠脊髓內炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失的影響Fig.5 Effects of HF on infiltration of inflammatory cells and demyelination in spinal cord of EAE mice

2.6 HF 對EAE 小鼠氧化應激的影響 與體外細胞實驗結果基本一致，與EAE 組相比，HF 顯著減少脊髓勻漿中氧化產物ROS、RNS 及MDA 含量（P<0.05），提高抗氧化酶SOD、CAT 和GSH-Px 含量，差異有統計學意義（P<0.05）。見圖6。

圖6 HF對EAE小鼠氧化應激的影響Fig.6 Effects of HF on oxidative stress in EAE mice

2.7 HF 激活Nrf2/HO-1抗氧化通路 Nrf2/HO-1是體內一條重要的抗氧化通路，為驗證HF 的抗氧化作用是否與Nrf2/HO-1 通路有關，采用免疫熒光染色和Western blot 檢測兩組小鼠脊髓內Nrf2 和HO-1的表達情況。結果顯示，與EAE 組相比，HF 組小鼠脊髓內Nrf2 和HO-1 蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義（P<0.05）。提示HF 可能通過激活Nrf2/HO-1信號通路發揮抗氧化作用。見圖7。

圖7 HF激活了Nrf2/HO-1抗氧化通路Fig.7 HF activated Nrf2/HO-1 antioxidant pathway

3 討論

由于CNS 巨大的耗氧量及少突膠質細胞的高脂質含量使其容易受到氧化應激的攻擊。在生理條件下，ROS 和RNS 作為信號傳導過程的調節介質發揮重要作用，而SOD、CAT 和GSH-Px 等酶構成了酶抗氧化劑系統，反饋性地抑制氧化產物的過多產生，維持氧化還原穩態［8-9］。ROS 和RNS 的過多產生、線粒體功能障礙、抗氧化防御系統功能不佳均在MS 的病理中發揮關鍵作用［10］。事實上，氧化應激會對所有類型的膠質細胞產生損傷，但由于少突膠質細胞本身缺乏抗氧化防御能力，少突膠質細胞和神經元更為敏感，因此氧化應激在MS 患者大腦中誘導線粒體損傷和能量障礙，從而導致髓鞘脫失和神經變性。神經炎癥和氧化應激密切相關，而在炎癥環境下，ROS 和RNS 水平急劇升高，導致細胞死亡［11］。研究發現在MS 患者腦內活動脫髓鞘區域，大量蛋白質、脂質和核苷酸受到廣泛的氧化損傷，受損的少突膠質細胞顯示高水平的氧化DNA，而氧化磷脂優先在運輸紊亂的軸突中積累［12］。有研究表明，ROCK 的激活能夠促進自由基過度產生，提高氧化應激水平，其還可由氧化應激狀態引起，加強惡性循環，最終導致神經元死亡［13-15］。在對EAE 小鼠CNS 氧化應激與神經元損傷之間的時空相關性研究中發現，激活的小膠質細胞是EAE 小鼠CNS內氧化損傷的主要來源之一［16］。因此在本實驗中采用LPS 刺激的BV2 細胞進行ROCK 抑制劑HF在體外抗氧化能力的研究。結果表明HF 可明顯減少氧化產物ROS、RNS 及MDA 產生，促進抗氧化酶SOD、CAT 和GSH-Px 表達，表現出良好的抗氧化能力，并且該結果在EAE小鼠中也得到驗證。

Nrf2 是一種重要的抗氧化防御的調節因子，在受到氧化刺激時，其可由胞質轉入核內，激活一種被稱為抗氧化反應元件的基因表達，通過調節多種抗氧化蛋白、解毒酶和外源性轉運蛋白的基礎和誘導表達，消除過多的氧化產物，在維持細胞穩態中發揮重要作用［17］。Nrf2的另一個重要功能是通過抑制NF-κB 激活降低炎癥反應，從而減少細胞因子的產生和氧化反應［18］。法舒地爾作為ROCK抑制劑可導致APP/PS1 轉基因癡呆模型小鼠海馬神經元中Nrf2 和抗氧化分子上調，因此可能是通過激活Nrf2信號通路，促進大腦抗凋亡能力，從而發揮神經保護作用［4］。有研究發現，法舒地爾靜脈給藥后，可以立刻在血液中檢測到HF，血漿中HF 的濃度最高值約為母物的80%［19］。因此，HF可能是法舒地爾的重要活性成分。本實驗在明確HF 抗氧化作用的基礎上，進一步探索了其作用機制，發現HF 也可促進EAE 小鼠脊髓中Nrf2和HO-1蛋白表達。HF對Nrf2信號通路的激活表明其有潛力成為治療MS 優良的抗氧化劑。

綜上所述，HF 在體外對DPPH 和ABST 自由基無直接清除作用，在體內則改善EAE 小鼠的臨床癥狀，減輕CNS 炎癥細胞浸潤和髓鞘脫失，表現出良好的治療效果，其機制可能與激活Nrf2/HO-1 信號通路，抑制氧化應激有關。基于文獻報道的其優良的藥物代謝動力學特征，使HF 在臨床治療上具有良好的應用前景。