蕎麥黃酮通過下調HMGB1抑制高糖誘導的人視網膜微血管內皮細胞損傷的研究

袁小波 彭小珊 周麗麗 唐 靜（湘潭市第一人民醫院醫學轉化中心，湘潭 411100）

糖尿病視網膜病變是糖尿病的常見并發癥，也是導致成年人失明的主要原因之一［1］。目前，糖尿病視網膜病變的發病機制尚不明確，研究認為，持續的高血糖造成的人視網膜微血管內皮細胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs）損傷是其發生發展的關鍵，因此，抑制高糖引起的HRMECs損傷對于糖尿病視網膜病變的治療尤為重要［2］。蕎麥黃酮是蕎麥的主要活性成分，具有降血糖、降脂、抗炎等功效［3］。有報道稱，蕎麥黃酮可抑制高糖誘導的腎小球系膜細胞炎癥因子表達和纖維化，其作用機制與下調細胞中長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）遠端缺失同源盒6反義RNA1（distal-less homeobox 6 antisense RNA1，DLX6-AS1）表達有關［4］。然而，蕎麥黃酮能否影響HRMECs 損傷還未知。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種炎癥因子，除參與調控炎癥反應外，還對細胞凋亡、氧化損傷等具有調控作用［5］。研究顯示，HMGB1 在糖尿病大鼠視網膜組織及高糖誘導的HRMECs 中均表達升高，敲減HMGB1 可通過抑制半胱天冬酶-3（caspase-3）活化及促進B淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）蛋白表達，減少高糖誘導的HRMECs 凋亡［6-7］。本研究建立高糖誘導的HRMECs 損傷模型，旨在觀察蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs 損傷的影響及其能否通過調控HMGB1 發揮作用，以期為其用于糖尿病視網膜病變的治療提供一定實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 HRMECs（上海信裕生物科技有限公司，批號：220518）；DMEM 培養液、膜聯蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白檢測試劑盒、細胞計數試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）試劑盒（北京索萊寶，批號：2022061211、2022270509、2022051627、2022041408）；聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）實驗試劑盒、胎牛血清（浙江天杭，批號：220425、220503）；蛋白質印跡實驗所需抗體（中國Abcam 公司，批號：20220408）；引物序列、HMGB1過表達載體（pcDNA-HMGB1）和空載體（pcDNA）（上海生工，批號：20220517、20220515、20220426）；LipofectamineTM2000試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：2022051611）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6 和IL-10 試劑盒（南京建成，批 號：220415、220520、220504、220328、220501、220408）。

1.2 方法

1.2.1 制備蕎麥黃酮 參照文獻［3］方法制備蕎麥黃酮：將購買并經鑒定的蕎麥花葉進行干燥，以1∶7（質量∶體積）添加50%乙醇，60 ℃回流2 h，提取3 次，合并濾液。將濾液用AB-8 打孔吸附樹脂分離，用水洗柱子，用50%乙醇解吸被吸附的提取物即為蕎麥黃酮。

1.2.2 細胞培養和轉染 復蘇HRMECs，用完全培養液（含10 %胎牛血清的DMEM 培養液）置于CO2培養箱中培養。于6 孔板中接種2.5 ml HRMECs（5.0×104個/ml），培養24 h 后，利用LipofectamineTM2000 試劑盒分別轉染pcDNA、pcDNA-HMGB1，轉染時間為12 h，將轉染后的細胞用于后續實驗。

1.2.3 CCK-8 檢測細胞增殖活性 ①于96 孔板中接種0.2 ml HRMECs（5.0×104個/ml），培養4 h 后，分別用含0、0.125、0.25、0.5、1、1.25、1.5、1.75、2 mg/ml 蕎麥黃酮的培養液培養24 h。②于96 孔板中接種0.2 ml HRMECs（5.0×104個/ml），培養4 h后，分為正常對照（NC）組、HG 組、HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組，NC 組細胞用常規培養液培養24 h，HG 組細胞用含30 mmol/L 葡萄糖的培養液培養24 h［7］，HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組細胞分別用0.5、1.0、2.0 mg/ml 蕎麥黃酮和30 mmol/L葡萄糖的培養液共同培養24 h［4］。③于96孔板中接種0.2 ml 轉染pcDNA、pcDNA-HMGB1 的HRMECs（5.0×104個/ml），均按照HG+高蕎麥黃酮組進行處理，并分別記為HG+蕎麥黃酮+pcDNA 組和HG+蕎麥黃酮+pcDNA-HMGB1 組。各組細胞培養結束后，向每孔中加10 μl CCK-8，孵育細胞2 h，置于酶標儀卡槽中，設置波長450 nm，檢測各孔光密度（OD）值。細胞抑制率（%）=（1-OD實驗組/OD對照組）×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 于6 孔板中接種2.5 ml HRMECs 或轉染pcDNA、pcDNA-HMGB1的HRMECs，培養4 h 后，按照上述1.2.3 中②和③分別分組培養。各組細胞培養結束后，PBS 清洗細胞。加500 μl結合緩沖液重懸細胞，加10 μl Annexin V-FITC，避光孵育15 min，再加5 μl PI，避光孵育5 min后，利用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡。

1.2.5 比色法檢測MDA、LDH 和SOD 細胞接種和培養同1.2.4。各組細胞培養結束后，將細胞用PBS 清洗后，加裂解液裂解，3 500 r/min 離心10 min后，取上清液，分別利用MDA、SOD 試劑盒檢測上清液中MDA含量、SOD 活性。將各組細胞培養上清液3 500 r/min離心10 min，取上清液，利用LDH 試劑盒檢測LDH漏出量。

1.2.6 ELISA 檢測TNF-α、IL-6和IL-10 細胞接種和培養同1.2.4。各組細胞培養結束后，收集細胞培養上清液，3 500 r/min 離心10 min。取上清液，分別采用TNF-α、IL-6 和IL-10 ELISA 試劑盒檢測其水平。

1.2.7 蛋白質印跡法檢測蛋白表達 細胞接種和培養同1.2.4。各組細胞培養結束后，將細胞用PBS清洗。用RIPA 試劑獲取細胞中總蛋白，BCA 試劑盒檢測蛋白濃度。用SDS-PAGE 實驗分離總蛋白，并轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h。于4 ℃冰箱中分別用B 淋巴細胞瘤-2 相關蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）（1∶500）、Bcl-2（1∶500）、HMGB1（1∶1 000）和內參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（1∶1 000）一抗孵育過夜，洗膜后，再用山羊抗兔二抗（1∶2 000）于37 ℃孵育1 h。加顯影液顯影，曝光拍照，Image J軟件分析Bax、Bcl-2 和HMGB1 相 對GAPDH 的 表達量。

1.2.8 RT-PCR 檢測HMGB1 mRNA 表達 細胞接種和培養同1.2.4。各組細胞培養結束后，采用RNA 提取試劑盒提取各組細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA 后，進行擴增。引物序列：HMGB1正向5′-TGCAGATGACAAGCAGCCTT-3′，反 向5′-GCTGCATCAGGCTTTCCTTT-3′；GAPDH 正 向5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反 向5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。2-ΔΔCt法計 算HMGB1 mRNA 相對GAPDH的表達量。

1.3 統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統計分析。各檢測指標均符合正態分布，以xˉ±s 表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較先用單因素方差進行分析，使用LSD-t檢驗進行組間兩兩比較。以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 蕎麥黃酮對HRMECs活性的影響 與0 mg/ml蕎麥黃酮組比較，不同劑量（0.125、0.25、0.5、1、1.25、1.5、1.75、2 mg/ml）蕎麥黃酮組HRMECs 抑制率無顯著變化，說明此劑量范圍內的蕎麥黃酮對HRMECs活性無顯著影響。見圖1。

圖1 蕎麥黃酮對HRMECs抑制率的影響Fig.1 Effect of buckwheat flavone on inhibition rate of HRMECs

2.2 蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs 凋亡的影響 與NG 組比較，HG 組HRMECs 抑制率、凋亡率、細胞中Bax 蛋白表達升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達降低（P<0.05）。與HG 組比較，HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組HRMECs抑制率、凋亡率、細胞中Bax 蛋白表達降低（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達升高（P<0.05），且HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組各檢測指標比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖2、表1。

表1 蕎麥黃酮對HRMECs凋亡的影響（，n=3）Tab.1 Effects of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis（，n=3）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

圖2 蕎麥黃酮對HG 誘導的HRMECs 凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表達的影響Fig.2 Effects of buckwheat flavone on HG-induced HRMECs apoptosis and expressions of Bax and Bcl-2 protein

2.3 蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs 氧化應激的影響 與NG 組比較，HG 組HRMECs 中MDA 含量、LDH 漏出量升高（P<0.05），SOD 活性降低（P<0.05）。與HG 組比較，HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組HRMECs 中MDA含量、LDH 漏出量降低（P<0.05），SOD活性升高（P<0.05），且HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組各檢測指標比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs 氧化應激的影響（，n=3）Tab.2 Effects of buckwheat flavone on high glucose-induced oxidative stress of HRMECs（，n=3）

表2 蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs 氧化應激的影響（，n=3）Tab.2 Effects of buckwheat flavone on high glucose-induced oxidative stress of HRMECs（，n=3）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

2.4 蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs 炎癥因子表達的影響 與NG 組比較，HG 組IL-6 和TNF-α 水平升高（P<0.05），IL-10水平降低（P<0.05）。與HG 組比較，HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組IL-6 和TNF-α 水平降低（P<0.05），IL-10 水平升高（P<0.05），且HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組各檢測指標比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs炎癥因子表達的影響（，n=3，pg/ml）Tab.3 Effects of buckwheat flavone on expressions of inflammatory factors in HRMECs induced by high glucose（，n=3，pg/ml）

表3 蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs炎癥因子表達的影響（，n=3，pg/ml）Tab.3 Effects of buckwheat flavone on expressions of inflammatory factors in HRMECs induced by high glucose（，n=3，pg/ml）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

2.5 蕎麥黃酮對高糖誘導的視網膜微血管內皮HRMECs 細胞中HMGB1 表達的影響 與NG 組比較，HG 組HMGB1 mRNA 和蛋白表達水平升高（P<0.05）。與HG 組比較，HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組HMGB1 mRNA 和蛋白表達水平降低（P<0.05），且HG+低蕎麥黃酮組、HG+中蕎麥黃酮組和HG+高蕎麥黃酮組各檢測指標比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見圖3、表4。

表4 蕎麥黃酮對HG 誘導的HRMECs 中HMGB1 表達的影響（，n=3）Tab.4 Effects of buckwheat flavone on expression of HMGB1 in HG-induced HRMECs（，n=3）

表4 蕎麥黃酮對HG 誘導的HRMECs 中HMGB1 表達的影響（，n=3）Tab.4 Effects of buckwheat flavone on expression of HMGB1 in HG-induced HRMECs（，n=3）

Note：Compared with NG group，1）P<0.05；compared with HG group，2）P<0.05；compared with HG+low buckwheat flavone group，3）P<0.05；compared with HG+middle buckwheat flavone group，4）P<0.05.

圖3 蕎麥黃酮對HG 誘導的HRMECs 中HMGB1 蛋白表達的影響Fig.3 Effects of buckwheat flavone on expression of HMGB1 protein in HG-induced HRMECs

2.6 過表達HMGB1 逆轉蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs 凋亡的影響 HG+蕎麥黃酮+pcDNAHMGB1組HRMECs中HMGB1 mRNA和蛋白表達量均高于HG+蕎麥黃酮+pcDNA組（P<0.05）。與HG+蕎麥黃酮+pcDNA 組比較，HG+蕎麥黃酮+pcDNAHMGB1 組HRMECs 抑制率、凋亡率、Bax 蛋白表達均升高（P<0.05），Bcl-2 蛋白表達降低（P<0.05）。見圖4、表5。

表5 過表達HMGB1逆轉蕎麥黃酮對HRMECs凋亡的影響（，n=3）Tab.5 Overexpression of HMGB1 reverses effect of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis（，n=3）

表5 過表達HMGB1逆轉蕎麥黃酮對HRMECs凋亡的影響（，n=3）Tab.5 Overexpression of HMGB1 reverses effect of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis（，n=3）

Note：Compared with HG+buckwheat flavone+pcDNA group，1）P<0.05.

圖4 過表達HMGB1 逆轉蕎麥黃酮對HRMECs 凋亡及HMGB1、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響Fig.4 Overexpression of HMGB1 reversed effects of buckwheat flavone on HRMECs apoptosis and protein expressions of HMGB1，Bax，Bcl-2

2.7 過表達HMGB1 逆轉蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs 氧化應激和炎癥因子表達的影響 與HG+蕎麥黃酮+pcDNA 組比較，HG+蕎麥黃酮+pc-DNA-HMGB1 組HRMECs 中MDA 含量、LDH 漏出量升高（P<0.05），SOD 活性降低（P<0.05），IL-6 和TNF-α 水平升高（P<0.05），IL-10 水平降低（P<0.05）。見表6。

表6 過表達HMGB1逆轉蕎麥黃酮對HG誘導的HRMECs氧化應激和炎癥因子表達的影響（，n=3）Tab.6 Overexpression of HMGB1 reverses effects of buckwheat flavone on HG-induced oxidative stress and inflammatory factors expressions in HRMECs（，n=3）

表6 過表達HMGB1逆轉蕎麥黃酮對HG誘導的HRMECs氧化應激和炎癥因子表達的影響（，n=3）Tab.6 Overexpression of HMGB1 reverses effects of buckwheat flavone on HG-induced oxidative stress and inflammatory factors expressions in HRMECs（，n=3）

Note：Compared with HG+buckwheat flavone+pcDNA group，1）P<0.05.

3 討論

近年來，由于居民飲食結構的改變，糖尿病發病率呈增長趨勢［8］。作為糖尿病的并發癥之一，糖尿病視網膜病變的發病率也隨之升高［9］。糖尿病患者長期處于高血糖狀態，高血糖可誘發HRMECs 產生過度的氧化應激、炎癥反應甚至凋亡，這也是糖尿病視網膜病變發生發展的重要原因。因此，抑制高糖誘導的HRMECs 損傷對糖尿病視網膜病變的治療尤為重要。本研究發現，不同濃度的蕎麥黃酮對HRMECs 活性無顯著影響，將適量濃度的蕎麥黃酮作用于高糖誘導的HRMECs，結果顯示，蕎麥黃酮能夠呈劑量依賴性地增強高糖誘導的HRMECs 活性，并減少細胞凋亡，提示其對HRMECs 發揮保護作用。Bax 是一種促凋亡分子，其表達增加時促進細胞凋亡；Bcl-2 則發揮抗凋亡作用，其表達增加對細胞凋亡起抑制作用［10］。本實驗數據顯示，蕎麥黃酮抑制了高糖誘導的HRMECs 中Bax 蛋白表達，促進了Bcl-2蛋白表達，說明其發揮抗高糖誘導的HRMECs凋亡與調控Bax/Bcl-2有關。

持續的高血糖可誘導HRMECs 氧自由基生成增加，自由基進一步與細胞膜脂質、細胞內蛋白質及核酸發生一系列氧化反應，造成細胞氧化損傷［11］。MDA 是脂質過氧化產物，其水平高低可間接反映細胞氧化應激水平［12］。SOD 是機體內重要的抗氧化酶，可清除自由基，減輕自由基對機體組織的氧化損傷［13］。在細胞受損時，細胞膜通透性發生改變，LDH 被釋放。因此，細胞培養上清液中LDH漏出量越高，說明細胞受損越嚴重［14］。本實驗數據顯示，蕎麥黃酮降低了高糖誘導的HRMECs 中MDA含量和LDH 漏出量，提高了細胞中SOD 活性，且呈劑量依賴性，提示蕎麥黃酮能夠減輕高糖誘導的HRMECs 氧化損傷。此外，持續的高血糖還可誘導HRMECs 發生炎癥反應，分泌過量炎癥因子促進糖尿病視網膜病變的發展。研究顯示，糖尿病視網膜病變患者視網膜組織中IL-6 和TNF-α 呈高表達，促進該疾病的發展［15］。IL-10屬于抗炎因子，對IL-6和TNF-α 等促炎因子具有抵抗作用，可緩解糖尿病視網膜病變患者炎癥狀態［16］。本實驗數據顯示，蕎麥黃酮抑制了高糖誘導的HRMECs分泌IL-6和TNF-α，而促進其分泌IL-10，且呈劑量依賴性，這說明蕎麥黃酮可減輕高糖誘導的HRMECs炎癥損傷。

HMGB1是一種炎癥因子，其參與調控細胞炎癥反應、氧化應激及細胞凋亡等生理或病理過程。研究顯示，miR-205-5p 可通過靶向下調HMGB1 減輕缺氧復氧誘導的海馬神經元炎癥反應和氧化應激，減輕腦缺血再灌注損傷［17］。既往研究顯示，HMGB1也參與糖尿病視網膜病變的發生發展，抑制HMGB1基因表達能夠改善糖尿病視網膜病變大鼠視網膜中央動脈的血流，并抑制炎癥反應及細胞凋亡［18］。本研究結果顯示，蕎麥黃酮呈劑量依賴性抑制高糖誘導的HRMECs 中HMGB1 mRNA 和蛋白表達，而過表達HMGB1 則逆轉了蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs增殖活性、凋亡、氧化應激及炎癥反應的影響，進一步提示蕎麥黃酮可能通過下調HMGB1 抑制高糖誘導的HRMECs 凋亡、氧化應激及炎癥反應。

綜上，一定劑量的蕎麥黃酮對高糖誘導的HRMECs 凋亡、氧化應激及炎癥反應具有顯著抑制作用，其作用機制可能與下調細胞中HMGB1 表達有關。HMGB1 受上游miRNA 調控，而miRNA 又受環狀RNA 和lncRNA 調控，因此，蕎麥黃酮可能通過作用于環狀RNA 或lncRNA 進而靶向miRNA 來調控HMGB1 表達，從而減輕高糖誘導的HRMECs 損傷，其具體作用的環狀RNA 或lncRNA 及miRNA 有待進一步探究。