鐵死亡相關基因DPP4與腫瘤免疫及預后的生物信息學研究①

陳 靜 張尚暖（山東第一醫科大學，山東省醫學科學院臨床與基礎醫學院，濟南 250117）

鐵死亡是近年發現與鐵依賴性相關的以細胞內活性氧堆積為特征的細胞死亡形式，不屬于細胞凋亡范疇［1］。鐵死亡在很多病理過程中作為應激反應對很多腫瘤抑制因子發揮促進作用，可能用于腫瘤臨床治療［2-3］。研究證實，部分已發生耐藥的腫瘤細胞對鐵死亡仍有高度敏感性，對腫瘤治療有重要作用［4-5］。DPP4（dipeptidyl peptidase-4）又稱為T 細胞表面抗原CD26，DPP4-NOX 結合是鐵死亡中脂質過氧化作用必需的關鍵因子，其異常表達與腫瘤形成發展密切相關［6］。泛癌分析可通過整合多個數據庫數據對腫瘤進行綜合分析，尋找目的基因組在不同腫瘤的表達相關性。盡管目前已對DDP4 進行了某些腫瘤相關研究，但對其在不同腫瘤之間的研究尚缺乏全面分析。考慮到鐵死亡相關基因DPP4 與腫瘤存在相關性，本研究擬對鐵死亡相關基因DPP4進行泛癌分析，探討其在不同腫瘤中的表達情況，并進行生存預后分析，重點分析其在腫瘤免疫方面的功能，以期為臨床腫瘤診斷、治療及預后提供靶向生物標志物。

1 資料與方法

1.1 數據獲取與預處理 從GTEx 數據庫下載31 個正常組織轉錄組測序數據作為研究對照組；從CCLE 數據庫下載21 個腫瘤細胞系數據，從TCGA數據庫下載33種腫瘤轉錄組數據，同時下載相應患者的臨床信息、腫瘤突變負荷和微衛星不穩定性等信息。TCGA中全部腫瘤類型縮寫見表1。

表1 TCGA中全部腫瘤類型縮寫Tab.1 Abbreviation for all tumor types in TCGA

1.2 DPP4 表達分析 采用R 軟件進行統計學分析，提取CCLE 數據庫和TCGA 數據庫中DPP4 表達數據，采用Kruskal-Wallis 檢驗比較不同細胞系中DPP4 表達；采用Wilcoxon 檢驗比較TCGA 數據庫中正常組和腫瘤組DPP4表達差異。

1.3 生存分析 采用單因素Cox 回歸分析評估TCGA 數據庫不同腫瘤中DPP4 基因表達與患者生存期的相關性；根據DPP4 基因表達中位值將患者分為DPP4高表達組與DPP4低表達組，Kaplan-Meier繪制每種腫瘤患者的生存曲線，log-rank檢驗分析生存狀況。

1.4 免疫評分、基質評分和綜合評分生成 使用“CIBERSORT”算法計算TIMER 數據庫中每種腫瘤免疫細胞浸潤情況。使用“ESTIMATE”軟件包計算基質評分、免疫評分及總評分評估患者腫瘤微環境。使用Spearman 檢驗從基質評分、免疫評分、免疫新抗原、腫瘤突變負荷、微衛星不穩定等方面評估DPP4基因表達與不同指標的相關性。

1.5 功能和通路富集分析 利用GSEA 軟件分析DPP4 基因表達與信號通路的關聯性，從MSigDB 數據庫已知數據集中選擇HALLMARK（特征基因集合，共50 組）及C2（curated gene sets，專家共識基因集合中KEGG）進行分析，一般認為|NES|>1，NOMP<0.05，FDRq<0.25 的通路顯著富集，對應其峰值右側的基因為該基因集的核心基因。

1.6 DPP4表達驗證 通過人類蛋白質圖譜數據庫和GEO數據庫中GSE12771、GSE109169、GSE103512數據集對DPP4表達進行分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 DPP4 在腫瘤細胞系和組織中的表達 DPP4基因在21類細胞系中均檢測到表達，其中在腎臟腫瘤、腸道腫瘤、胸膜腫瘤等13類細胞系中表達較高，在骨腫瘤、乳腺腫瘤及中樞神經系統腫瘤等8 類細胞系中表達較低（圖1A）。與正常組織相比，BRCA、COAD 及UCEC 等22 種腫瘤中DPP4 表達差異顯著（P<0.001），KIRP 中表達存在一定差異（P<0.05），在BLCA、HNSC、CESC及OV 4種腫瘤中表達差異無統計學意義（P>0.05）；其中，在表達有統計學意義的23 種腫瘤中，DPP4 在ESCA、LUAD 等16 種腫瘤中呈高表達，在KICH、SKCM等7種腫瘤中呈低表達（圖1B）。

圖1 DPP4在腫瘤細胞系和組織中的表達Fig.1 Expression of DPP4 in tumor cell lines and tissues

2.2 DPP4表達與生存預后的關系 單因素生存分析結果顯示：DPP4 表達升高在PCPG（HR=0.61，P<0.001）、THYM（HR=0.92，P<0.001）中可作為顯著的保護因素，對腫瘤預后有正向作用（圖2A）。10種差異顯著的腫瘤預后Kaplan-Meier 曲線中，DPP4 基因高表達在ACC、DLBC、LGG、BRCA、LAML、PRAD中與生存時間呈負相關，表明DPP4 高表達與ACC、DLBC、LGG、BRCA、LAML、PRAD 6 種腫瘤的不良OS 相關，且可降低腫瘤患者生存率；而在KIRP、THCA、KIRC、THYM 中DPP4 高表達與生存時間呈正相關，且可提高腫瘤患者生存率（圖2B～K）。

圖2 DPP4 在33 種腫瘤中表達與總體生存期關系的Kaplan-Meier圖及單因素生存分析森林圖Fig.2 Kaplan-Meier plot and univariate survival analysis forest plot of relationship between DPP4 expression and overall survival in 33 tumors

2.3 DPP4 基因在腫瘤中的表達與免疫調節的關系 BLCA、BRCA、CESC 與6 種免疫細胞（B 細胞、CD4+T 細胞、CD8+T 細胞、巨噬細胞、中性粒細胞及樹突狀細胞）浸潤密切相關（圖3A），說明DPP4基因表達與腫瘤免疫細胞浸潤關系密切；此外，結果顯示DPP4 在BLCA、BRCA、PCPG 3 種腫瘤中評分最高，且呈正相關（圖3B）。同時收集常見的40 多個免疫檢查點基因，Spearman 相關性分析研究DPP4基因表達與免疫檢查點基因的表達關系，分別提取這些免疫檢查點基因，計算與目標基因表達的相關性（圖3C），DPP4 基因表達與NRP1、HAVCR2、CD86等多個免疫檢查點基因高度相關（P<0.01）。

2.4 DPP4基因表達與免疫新抗原、腫瘤突變負荷、微衛星不穩定性的關系 DPP4 在GBM、BRCA、KIRP、CESC 中與腫瘤新生抗原個數相關（P<0.05，圖4），增加了腫瘤的免疫原性；DPP4 表達與UCEC、THYM、SARC、PRAD、OV、LUSC、LAVL、KIRP、ESCA、COAD 10 種腫瘤突變存在統計學相關性（P<0.05，圖5A），在ESCA 中呈顯著正相關（P<0.001），在THYM 中呈顯著負相關（P<0.001）；DPP4 表達與UCS、TGCT、SKCM、PRAD、LUSC、LUAD、KIRC、HNSC、ESCA、DLBC、COAD 11種腫瘤微衛星不穩定性相關，與COAD 呈顯著正相關（P<0.001），與DLBC呈顯著負相關（P<0.001，圖5B）。

2.5 DPP4 高低表達組GSEA 分析 GSEA 分析顯示，KEGG分析中，病毒性心肌炎、哮喘及FcεRⅠ信號通路3 者基因集顯著聚集于高表達組，維生素A代謝、苯基丙氨酸代謝、酪氨酸代謝及細胞色素P450 對異生物質代謝等通路富集于低表達組（P<0.05，圖6）。HALLMARK 通路分析中，炎癥反應、干擾素α 反應及IL6-JAK-STAT3 通路基因富集于DPP4 高表達組；而G2M 檢查點、雌激素反應性晚期、E2F 靶點及活性氧通路4 個通路基因集于DPP4低表達組富集。

圖6 DPP4差異表達組KEGG 和HALLMARK 通路GSEA富集Fig.6 GSEA enrichment of KEGG and HALLMARK pathways in DPP4 differential expression groups

2.6 免疫組化和測序數據證實DPP4 在肺癌、乳腺癌、直腸癌和前列腺癌中表達存在差異 通過檢索人類蛋白質圖譜數據庫分析正常組織和癌組織中DPP4表達，發現在肺癌、乳腺癌、前列腺癌和直腸癌中，DPP4 呈顯著高表達；通過檢索TCGA 數據庫和GEO 數據庫中相關腫瘤測序結果，對DPP4 基因表達量進行比較，肺癌、前列腺癌、直腸癌中DPP4 呈顯著高表達，而在乳腺癌中表達降低（圖7）。

圖7 DPP4 在肺癌（A）、乳腺癌（B）、直腸癌（C）及前列腺癌（D）中差異表達Fig.7 Differential expression of DPP4 in lung cancer（A），breast cancer（B），rectal cancer（C）and prostate cancer（D）

3 討論

目前鮮有關于DPP4 作為腫瘤標志物的研究，已有研究證實腫瘤與鐵死亡關系密切，且鐵死亡在腫瘤侵襲中的作用已成為研究熱點之一［7-8］。研究發現抑癌基因P53 可通過促進DPP4 進入細胞核并形成DPP4-P53 復合物抑制結直腸癌細胞鐵死亡［9］。抑制DPP4表達可顯著抑制鐵死亡，尤其在P53敲除的細胞中［10］。DPP4 與T 細胞密切相關［11］。基于鐵死亡在腫瘤診斷治療方面的優勢，鐵死亡相關的DPP4 基因可能在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用，可作為一種潛在的泛癌生物標志物。

基于生物信息學分析，DPP4在不同腫瘤細胞系中存在差異表達；除BLCA、HNSC、CESC 及OV 4 種腫瘤外，其他腫瘤組織中均存在差異表達，與DPP4蛋白作用密切相關。研究表明DPP4 在T 細胞活化中起作用，且與細胞內信號轉導、細胞凋亡有關，參與腫瘤生物學過程，至少有63 種底物能與DPP4 酶特異結合，包括生長因子、趨化因子、神經肽等［12］。此外，DPP4通過切割腸促胰島素樣多肽和胰高血糖素樣肽-1 等腸促胰島素在葡萄糖代謝中發揮重要作用。將DPP4 作為主要統計因素，其在不同腫瘤中總體生存率存在較大差異，表明DPP4 可用于腫瘤預后評估，具有作為泛癌標志物的潛力。

為探究DPP4 如何在腫瘤發生、發展中發揮作用，本研究從腫瘤免疫、腫瘤突變及相關信號通路3 方面進行DPP4 生物功能分析，在腫瘤免疫方面，DPP4 參與BLCA、BRCA、CESC 3 種腫瘤免疫調節。免疫評分作為標志物對腫瘤患者治療及預后可提供有價值的預測已越來越受關注［13］。本研究證實在BLCA、BRCA、PCPG 中DPP4 與免疫微環境呈正相關。DPP4 基因表達可能參與腫瘤多種免疫細胞浸潤，且與腫瘤免疫成分、基質成分密切相關，Spearman 相關性分析進一步證實DPP4 與多個免疫檢查點基因高度相關，提示DPP4 可能是多數腫瘤中調節免疫成分的潛在指標，在腫瘤免疫調節中發揮重要作用，腫瘤細胞與免疫細胞相互作用為尋找更有效的腫瘤免疫治療方案提供了新觀點。腫瘤突變方面，DPP4在GBM、BRCA、KIRP、CESC 中與腫瘤新生抗原個數相關，增加了腫瘤的免疫原性，與DPP4 在免疫微環境中的作用非常相似，說明DPP4可作為很好的免疫治療靶點；另外發現DPP4 在UCEC、THYM、SARC、PRAD、OV、LUSC、LAVL、KIRP、ESCA、COAD 10 種腫瘤中明顯突變，與腫瘤突變負荷明顯相關；在UCS、TGCT、SKCM、PRAD、LUSC、LUAD、KIRC、HNSC、ESCA、DLBC、COAD 中與微衛星不穩定顯著相關。已證實腫瘤突變負荷和微衛星不穩定可預測患者多種藥物反應，尤其是免疫檢查點抑制劑［14-16］。研究表明，高腫瘤突變負荷、微衛星不穩定與良好的免疫檢查點抑制劑藥物反應相關［17-19］。提示DPP4 也可用于預測腫瘤免疫治療應答，可作為藥物治療效果的評價指標。為進一步研究DPP4 在腫瘤中高低表達與信號通路的相關性，GSEA 富集分析結果表明DPP4 高低表達組KEGG 通路主要集中于維生素A、酪氨酸等物質代謝通路，HALLMARK 通路主要富集于炎癥反應通路，而這些通路中有些已證實與鐵死亡通路密切相關［20］。為證實上述結果的可靠性，經人類蛋白質圖譜檢索結果得出肺癌、乳腺癌、前列腺癌和直腸癌中DPP4 表達具有顯著差異，且TCGA 和GEO 中的測序結果也與其相互印證，雖然目前圖譜中涉及的DPP4 癌組織僅有4 種，但為后續實驗驗證DPP4 的泛癌標志物作用指明了方向。

綜上，鐵死亡相關基因DPP4 具有潛在的免疫調節能力，可通過物質代謝、炎癥反應等相關通路調控腫瘤的發生發展，可作為潛在的泛癌生物標志物用于腫瘤免疫輔助治療及預后評估。