基于蛋白質組學的艾滋病肺脾氣虛證PBMC小G蛋白相關研究①

于楨鈺 張 淼 王 娟 馬素娜 謝世平 許前磊（河南中醫藥大學，鄭州 450046）

小G 蛋白屬于G 蛋白大家族，除了參與細胞的生長增殖、細胞骨架調節及細胞信號轉導等外，也與免疫、炎癥、自噬及凋亡等方面密切相關［1-4］。獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immune deficiency syndrome，AIDS）即艾滋病，是感染人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）后，CD4 免疫細胞被攻擊引起一系列免疫缺陷的傳染性疾?。?］。研究發現，小G 蛋白在艾滋病感染進程中扮演重要角色，不論是其進入及潛伏的機制，還是后續激活發病分泌等機制均有重要聯系，但具體機制尚不明確［6-8］。肺脾氣虛證是艾滋病感染者的常見證候之一，氣是維持人體細胞運化的關鍵，小G蛋白作為細胞骨架的重要組成及其信號調節者，與氣的推動、防御及氣化功能十分相似，因此本研究選取了艾滋病肺脾氣虛證外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）進行研究［9］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本來源 收集2018 年河南省某地艾滋病肺脾氣虛證患者及同地區健康對照者血液樣本各20例，提取PBMC，設為艾滋病肺脾氣虛證組及健康對照組，進行iTRAQ-MS 檢測。獲取一般信息，對艾滋病肺脾氣虛證組及健康對照組的性別與年齡進行統計，差異無統計學意義，說明組間具有可比性（表1）。中醫證型診斷標準：參考課題組“艾滋病中醫證候分布規律及證候標準建立與驗證”中“HIV/AIDS 常見證候診斷量表”肺脾氣虛證診斷量表（編號：90409004）［10］。艾滋病肺脾氣虛證組納入標準：①HIV 抗體陽性且中醫診斷為肺脾氣虛證；②年齡18～60 歲；③自愿簽署知情同意書者。排除標準：①患者并發嚴重機會性感染者；②神志不清、癡呆、不愿配合及不愿簽署知情同意書者。健康對照組納入標準：①同地區HIV 抗體檢測陰性者，年齡為18～60 歲；②無嚴重臟器疾病或慢性病急性發作者；③無神志不清、癡呆、各種精神病者；④自愿簽署知情同意書者。本研究經河南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準（批件號：2018HL-050-01）。

表1 HIV/AIDS 肺脾氣虛證組（F）與健康對照組（J）基線資料Tab.1 Baseline data of HIV/AIDS lung spleen qi deficiency syndrome group（F）and healthy control group（J）

1.1.2 主要儀器及試劑 Human 14 多重離心親和去除系統購自Agilent；iTRAQ 試劑盒購自AB SCIEX公司；C18柱購自Sigma。

1.2 方法

1.2.1 PBMC的提取 EDTA 真空采血管采集入組者晨起外周血10 ml，加等體積PBS吹打均勻。將稀釋后的血液緩慢加在Ficoll液面上，2 000 r/min離心20 min，收取白膜層（PBMC），洗滌離心（1 500 r/min 10 min），重復2 次。棄上清加1 ml 細胞凍存液，-80 ℃保存。

1.2.2 iTRAQ-MS檢測

1.2.2.1 樣本采集及混合 艾滋病肺脾氣虛證組的20 例PBMC 標本分為4組，記為FP01、FP02、FP03、FP04。健康對照組的20 例PBMC 標本分為4 組，記為JK01、JK02、JK03、JK04。每組5 例，每例取出10 μl樣品置于EP管中渦旋混合。

1.2.2.2 蛋白質的提取及定量 在樣本中加入蛋白裂解液混勻，冰浴5 min，加入DTT，冰浴超聲15 min，13 000 g 離心20 min，加入冷丙酮，-20 ℃過夜，加入TEAB 溶解，56 ℃水浴30 min，靜置30 min，采用Bradford 法測定蛋白濃度。

1.2.2.3 蛋白質酶解及iTRAQ 標記 胰蛋白酶消化樣品蛋白質，將酶解后的肽段經C18 柱脫鹽真空冷燥，加入TEAB 溶解多肽，按照iTRAQ-8 試劑盒說明書進行標記混合。

1.2.2.4 液相色譜-質譜分析 2%乙腈/0.1%甲酸溶解多肽樣本后，應用質譜儀分析樣本，多肽溶液與C18 捕獲柱洗脫（緩沖液梯度90 min，流速300 nL/min），流動相A：2%乙腈/0.1%甲酸/98%H2O，流動相B：98%乙腈/0.1%甲酸/2%H2O。在離子累積時間為250 ms 條件下進行一級質譜圖掃描，離子累積時間50 ms條件下收集30個前體離子的二級質譜圖。MS1 光譜于350～1 500 m/z 條件內收集，MS2光譜在100～1 500 m/z條件下收集。

1.3 統計學分析 采用SPSS21.0統計軟件分析數據。計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗，計數資料組間對比采用卡方檢驗。按照flod change>1.5 或flod change<0.67 標準篩選，P<0.05 結果視為差異蛋白，組間對比采用t檢驗進行差異顯著性評估。查庫鑒定：將差異蛋白在UniProt（https：//beta.uniprot.org）網站中進行搜索。

2 結果

2.1 一般信息 對艾滋病肺脾氣虛證組（F）及健康對照組（J）的性別與年齡進行統計比較，P>0.05，表明組間具有可比性（表1）。

2.2 蛋白鑒定結果 如表2 所示，按照篩選標準，結果顯示相比于健康對照組，艾滋病肺脾氣虛證組差異表達蛋白為222 個，其中上調蛋白169 個，下調蛋白53 個。將差異蛋白在UniProt 網站中進行搜索，篩出小G 家族相關蛋白，結果顯示9 個顯著上調的小G 蛋白，分別為：Rho 家族Rac1、Cdc42、RhoA；Rab 家 族Rab7A、Rab8A、Rab13、Rab21、Rab27B；Rap家族Rap2B。

表2 HIV/AIDS 肺脾氣虛證組（F）與健康對照組（J）差異小G蛋白Tab.2 Difference of small G protein between HIV/AIDS lung slpeen qi deficiency syndrome group（F）and healthy control group（J）

3 討論

小G 蛋白是細胞活動的關鍵調節者，作為不活躍的鳥苷二磷酸（GDP）結合狀態和活躍的鳥苷三磷酸（GTP）結合狀態的分子開關，作用于整個細胞，包括細胞膜、細胞質和細胞核，調節了細胞的增殖分化、細胞信號、囊泡運輸、遷移或凋亡等［1，11-12］。小G蛋白家族包括Rho、Rab、Rap 等成員，其中Rho 主要參與細胞骨架的動力與形態，Rab 主要負責膜轉運及囊泡運輸，Rap 參與細胞的黏附、遷移及信號轉導等［11，13］。小G 蛋白作為GDP/GTP 分子開關，通過招募特定結合伙伴，如各種激酶、磷酸酶及運動蛋白影響囊泡的形成和運輸，HIV 病毒可利用細胞運輸機制組裝和釋放新的傳染性顆粒［14］。本實驗運用iTRAQ-MS 蛋白質組學檢測方法，以艾滋病肺脾氣虛證為研究對象，篩選出其與健康對照組PBMC 差異表達的9個小G蛋白。

3.1 Rho GTPase 家族 RhoA、Rac1 和Cdc42 在本次實驗中顯著上調，三者關系密切，且皆為Rho GTPase 家族成員，在病毒生命周期的不同階段調節HIV-1 的復制，參與病毒的進入、轉錄和釋放［14］。HIV 可通過Env 包膜蛋白觸發RhoA、Rac1 與Cdc42信號激活；RhoA 和Rac1 通過提高Env 蛋白與CD4和輔助受體分子（CXCR4/CCR5）的結合聚集及病毒-細胞膜融合的效率促進HIV-1 病毒的進入；CD4和輔助受體分子CCR5 的病毒接合又激活Rac1 和Cdc42，并導致GTPase 信號級聯中蛋白質大規模磷酸化與肌動蛋白重塑，可促進HIV 病毒融合孔的形成和擴大［6，12，15-16］。與Env 蛋白相似，Nef 也 介 導Rac1 活性，Env 與Nef 的介導效應與Rac1/Cdc42-Wave2-Arp2/3 肌動蛋白聚合途徑有關［17］。LUCERA等［8］研究表明細胞骨架調節因子Rho GTPase家族中RhoA、Cdc42 和RhoA 的抑制劑可降低病毒感染，表明Rho 信號家族的多個成員是促進CD4+T 細胞最佳HIV-1 感染的宿主依賴性因素。NIKOLIC 等［16］研究表明HIV-1 激活了Cdc42，促進了HIV 病毒在樹狀突細胞和CD4+T細胞之間形成的感染性突觸間的傳播。總之，Rho 家族中RhoA、Rac1 和Cdc42 與細胞骨架調節密切相關，且與HIV 病毒的進入、復制及傳播有關，而抑制其相關活性可減少病毒感染。本研究中，Rho 家族中RhoA、Rac1 和Cdc42 蛋白對比健康組呈現的上調差異可能與病毒感染相關，對此需進一步實驗驗證。

3.2 Rab GTPase 家 族 Rab7A、Rab8A、Rab13、Rab27B、Rab21 等差異蛋白在本次實驗結果中上調，其屬于GTPase 家族中的Rab 家族。Rab GTPase蛋白除了與HIV 病毒感染相關，也與自噬及細胞凋亡炎癥關系密切［2，4，18］。

CAILLET 等［14］證明了Rab7A 是HIV-1繁殖所必需的，Rab7A 調節Env 蛋白的加工與HIV-1 的傳染性，Rab7A 耗竭降低了Env 的加工，削弱了病毒的傳染性；Rab7A 敲除細胞釋放的病毒，傳染性降低，其與限制性因子BST2 的表達有關（BST2 可將新形成的病毒顆粒物理束縛在感染細胞表面，阻止其釋放）。RAB7A 能夠調節AKT（蛋白激酶B）和PAK1（P21-activated kinase1）活性，AKT 和PAK 都與細胞凋亡通路有關；而RAB7A 的過度表達也導致NF-κB表達增加［3］。MARGIOTTA 等［19］實驗表明Rab7A 控制晚期內吞轉運，直接與Rac1 相互作用，Rab7A 和Rac1 之間的協調是將自噬與細胞內運輸和信號傳遞相結合的關鍵。BAYLISS 等［20］實驗發現Rab8A是HIV-1轉運到病毒學突觸（VS）從而感染CD4+T細胞的重要調節因子，敲除Rab8A 潛在地阻止了病毒通過VS的有效反式感染，Rab8A可控制囊泡運輸和促進膜突起，Rab8A缺失抑制了膜的突起，從而減少了HIV-1的反式感染。Rab13通過激活AMP 依賴的蛋白激酶（AMPK），阻斷mTOR 信號轉導靶點，從而調節細胞自噬［18］。Rab27b 參與了內體-溶酶體途徑，與Rab8A 共同參與了自噬體形成［21］。LI 等［22］研究表明Rab21 可通過促進TLR4 內體運輸和下游信號激活調節脂多糖誘導的促炎反應，Rab21 的敲除有效抑制了脂多糖誘導的多種促炎細胞因子如IL-1b、IL-6和TNF-α表達。

以上結果表明，Rab 相關的幾個蛋白的下調或敲除限制了病毒感染，而其上調與激活似乎誘導加重了炎癥反應及自噬。在本實驗中，Rab7A、Rab8A出現上調，這可能說明HIV/AIDS肺脾氣虛證患者體內存在正在進行的病毒細胞間感染。相關Rab蛋白同時出現上調也可能與HIV/AIDS 長期慢性感染炎癥相關，尚需進一步實驗證明。

3.3 Rap GTPase 家 族 Rap2B 是Rap GTPase 成員，參與調節細胞過程，包括細胞骨架組織和細胞增殖，Rap2B相關轉導在自噬過程、突觸形成等方面作用復雜［23］。Rap2B 誘導了ERK 的磷酸化，是p53的直接靶基因，在細胞凋亡和遷移的調控中以p53依賴的方式發揮作用［24-25］。Rap2B 同時可以促進MAPK/ERK、PI3K/AKT 和NF-κB 等多種信號通路的激活［26］。MAPK/ERK、PI3K/AKT 和NF-κB 等通路與HIV 的感染與致病密切相關，HIV 病毒Nef 及Tat 蛋白可通過調控T 細胞 ERK 激酶活性調節病毒的轉錄、感染及復制［27-28］。DEL等［29］研究也表明HIV-1感染改變了T 細胞表面分子表達，改變了細胞骨架重塑及相關的細胞事件，并通過影響各種信號通路調節T 細胞活化。Rap2B 在艾滋病肺脾氣虛證組中上調，可能與病毒感染導致的T細胞活化相關。

肺脾氣虛證是艾滋病中最常見的臨床證型之一，肺脾氣虛證患者易出現感冒、咳嗽、泄瀉、自汗、乏力等癥狀，肺脾氣虛證患者由于肺之生發百脈主治節功能受損，脾之氣血生化來源不足，引起氣的推動、防御及氣化功能下降，導致感染者正氣不足，抵抗力弱，機體內環境調節出現紊亂。實驗中發現了9 個上調的小G 蛋白差異表達，結合文獻研究發現小G 蛋白Rho GTPase 家族在病毒的伊始攻擊中發揮更重要作用，Rab GTPase、Rap GTPase 家族在病毒進入細胞后的復制轉錄及激活各種通路引發的后續炎癥、自噬和凋亡等中發揮作用，這正與機體各方面機能代謝信號傳導密切相關，但其在感染HIV病毒病程及肺脾氣虛證中的具體功能作用仍處于探索階段。本研究進行了證型的初步蛋白篩選，有助于進一步研究小G蛋白與艾滋病肺脾氣虛證的感染及發病相關機制，課題組后期將對小G 蛋白進行深入研究，以期為中西醫結合治療艾滋病提供新思路。