基于PLS-DA的IgG介導的雞肉不耐受差異蛋白篩選及通路識別*

趙思淵 孫 琳 田 偉 劉美娜

哈爾濱醫科大學流行病與衛生統計學系(150081)

【提 要】 目的 篩選雞肉不耐受患者與健康人之間的差異蛋白,富集分析識別差異蛋白的相關通路,為探討雞肉不耐受發生機制提供依據。方法 收集雞肉不耐受患者及健康對照的血清樣本,利用DIA技術平臺對樣本進行蛋白組學檢測;PLS-DA結合PPI分析篩選具有相互作用的蛋白質,Cytoscape獲得雞肉不耐受患者與對照組間的差異蛋白;GO和KEGG富集分析獲得差異蛋白的生物學通路與代謝通路。結果 血清樣本的蛋白表達數據檢測結果,共獲得2210種蛋白質。PLS-DA分析篩選出和雞肉不耐受相關的蛋白質786個,結合蛋白互作分析獲得PPI網絡,聚類后得到兩個主要的模塊:cluster1和cluster2;cluster1包括18個蛋白質,cluster 2包括12個蛋白質。兩模塊蛋白質進行重要性排序,篩選出雞肉不耐受患者與健康對照間的差異蛋白為:ORM1、FGB、SERPINF2、HRG、A2M、ORM2和QSOX1。前五個為上調蛋白質,后兩個為下調蛋白質。cluster1評分為10.12,GO富集分析發現差異蛋白主要參與血小板脫顆粒、肽鏈內切酶活性的負調節、炎癥反應等生物學通路,KEGG分析富集到補體和凝血級聯通路;cluster 2評分6.00,共包括12個蛋白質,GO富集分析發現差異蛋白與急性期反應、血小板脫顆粒、固有免疫應答等生物學通路有關,KEGG分析富集到補體和凝血級聯通路、阮病毒病和系統性紅斑狼瘡的疾病通路。結論 本研究篩選出7個與IgG介導的雞肉不耐受相關的差異蛋白,其參與的生物學和代謝通路與機體免疫、炎癥過程有關,在免疫、炎癥發生發展中可能起重要作用,將為探討雞肉不耐受發生機制提供依據。

食物不耐受是一種以IgG介導的變態反應性疾病,人群患病率20%左右[1],其中,雞肉不耐受的發生較為常見。雞肉不耐受患者食用雞肉類食物會引起一系列胃腸道癥狀及肥胖、高血壓、偏頭痛等疾病[2],長期食用甚至累及消化、神經、心血管等全身多個系統,呈現出不同的臨床癥狀[3]。雞肉不耐受的治療以飲食干預為主,只有部分患者可從飲食干預中獲益[4]。食物不耐受的發生是由于未被吸收的蛋白質與IgG結合的免疫復合物引起[5],從蛋白質組學的角度出發,識別雞肉不耐受差異蛋白及通路,對于雞肉不耐受發生機制及其治療有重要意義。因此,本研究利用PLS-DA方法結合蛋白質互作分析篩選雞肉不耐受患者的差異蛋白,富集分析解釋差異蛋白并獲得差異蛋白的生物學及代謝通路,為雞肉不耐受的治療奠定基礎。

方 法

1.研究對象

研究樣本來源于某醫院過敏反應科患者,根據酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測結果,檢測值<50IU/ml為陰性。50～100IU/ml為輕度敏感,100～200IU/ml為中度敏感,超過200IU/ml 高度敏感。排除其他食物IgG抗體陽性患者,選擇雞肉不耐受的患者7例作為病例組;對照組為年齡、性別與患者匹配一致的健康人13例,IgG檢測結果見表1。收集研究對象血液樣本并離心,取上清液進行蛋白質組學檢測。

表1 雞肉不耐受患者及對照組IgG檢測結果

2.蛋白組學檢測及數據處理

利用數據非依賴性采集(data-independent acquisition,DIA)技術平臺對血清樣本進行蛋白質組學檢測,DIA技術是目前最常用的蛋白質組學定量分析質譜掃描技術,能夠將LC-MS/MS質譜儀的全掃描范圍劃分成若干個窗口,并將通過窗口的全部肽段離子進行碎裂,利用二級質譜檢測碎片離子的信號,獲得離子全部信息,有較高的準確性和重現性,適合于大樣本的復雜數據。

數據的標準化及標度化處理:采用總離子強度標準化法使得各樣本數據有可比性;通過自標度化法,將所有蛋白質強度的標準差都設為1,避免由于蛋白質表達量的絕對差異造成對低濃度代謝物數據的掩蓋。

3.差異蛋白篩選及通路識別

偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)[6]是一種有監督的判別分析方法,利用偏最小二乘回歸的思想,進行數據降維,并建立回歸模型,綜合應用相關分析、主成分分析(principal components analysis,PCA)和多元線性回歸等方法,建立蛋白表達量與樣品類別之間的關系模型,實現對樣品類別的預測;繪制PLS-DA評分圖,利用PLS-DA模型中變量投影重要度(variable important for the projection,VIP)衡量各蛋白質表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力,通過VIP值>1且P≤0.05選擇與雞肉不耐受相關的蛋白質。利用STRING網站繪制蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)網絡圖,可觀察到蛋白質之間的相互作用關系,篩選與雞肉不耐受相關的蛋白質。Cytoscape軟件進行PPI網絡聚類得到重要模塊,通過重要性排序獲得差異蛋白。

利用DAVID網站對獲得的差異蛋白進行GO富集分析[7]和KEGG通路富集分析[8],獲得包括生物學過程(biological process,BP)、細胞定位(cellular component,CC)和分子功能(molecular function,MF)在內的差異蛋白注釋信息以及機體新陳代謝、遺傳、疾病等通路。

結 果

1.差異蛋白篩選結果

雞肉不耐受患者和健康者的血清樣本通過蛋白表達數據檢測及標準化、標度化處理,共獲得2210種蛋白質。在事先確定樣本的類型歸屬條件下,通過對該數據進行有監督的PLS-DA分析可以最大程度顯示組間差異,PLS-DA評分圖顯示雞肉不耐受組與對照組明顯分離,見圖1。

圖1 雞肉不耐受與對照組PLS-DA評分

PLS-DA模型經過200次置換檢驗,顯示其具有較好的解釋能力(R2=0.846)和預測能力(Q2=-0.0548),見圖2。利用Bonferroni法對兩獨立樣本t檢驗得到的P值進行校正,火山圖見圖3。根據P值≤0.05結合VIP值大于1篩選出786個與雞肉不耐受相關蛋白質,其中,上調蛋白質167個,下調蛋白質619個。

圖3 雞肉不耐受組與對照組的兩獨立樣本t檢驗P值火山圖

2.蛋白質互作分析

利用STRING網站對786個雞肉不耐受相關蛋白質進行蛋白互作分析,共得到67個具有相互作用的蛋白質。通過Cytoscape進行PPI網絡聚類獲得兩個評分較高的蛋白質模塊:cluster1、cluster 2。cluster 1包括18個蛋白質,評分10.12,見圖4(a); cluster 2包括12個蛋白質,評分為6.00,見圖4(b)。進行重要性排序后,兩模塊篩選出排名前7位的蛋白質,分別為:ORM1、FGB、SERPINF2、A2M、QSOX1、HRG、ORM2。篩選的7個蛋白質中有5個在病例組上調,分別為ORM1、FGB、SERPINF2、HRG、A2M;2個在病例組下調,即ORM2和QSOX1。

圖4 兩蛋白質模塊雞肉不耐受組與對照組的蛋白質互作圖

3.通路識別結果

兩個蛋白質模塊分別進行GO和KEGG富集分析。cluster 1共包括18個蛋白質,GO分析表明差異蛋白與血小板脫顆粒、肽鏈內切酶活性的負調節、炎癥反應等生物學通路有關,見圖5(a),KEGG分析富集到補體和凝血級聯通路;Cluster 2共包括12個蛋白質,GO富集分析結果為急性期反應、血小板脫顆粒、固有免疫應答等生物學通路,見圖5(b),KEGG分析富集到補體和凝血級聯通路、阮病毒病以及系統性紅斑狼瘡的疾病通路。

圖5 兩個蛋白質模塊GO富集分析結果

討 論

雞肉不耐受的發生在人群中較為常見,飲食干預并非對所有患者有效,從蛋白質組學的角度篩選雞肉不耐受患者差異蛋白,能夠為其發生機制和治療提供新的思路。蛋白質組學數據具有高維、高噪聲、小樣本的特點,通過PLS-DA將蛋白數據轉換為誤差盡可能小的低維空間[9];篩選后得到的特征變量不僅能很好的概括原始變量的信息,而且有很強的解釋能力。本研究利用PLS-DA方法,結合蛋白質互作分析,篩選出7個雞肉不耐受患者差異蛋白,在病例組中上調蛋白質有5個,下調蛋白質有2個。

在上調蛋白質中,一型類黏蛋白(ORM1)在機體遭受感染和炎癥等刺激時升高,可作為炎癥出現和消退的標志[10],還可以轉運藥物、調節機體免疫反應,保護毛細血管屏障、調節能量平衡[11],維持內環境的穩定。α2-巨球蛋白(A2M)與細胞因子IL-6結合可參與機體急性期反應、免疫應答等過程[12]。絲氨酸蛋白酶抑制劑(SERPINF2)作為調控物,調節絲氨酸蛋白酶的水解平衡,參與機體免疫反應,對機體補體形成、纖溶、細胞內蛋白水解等生化反應和生理功能有重要作用[13]。富組氨酸糖蛋白(HRG)能夠與不同的配體結合發揮不同的功能,包括纖溶、血液凝固、免疫復合物的清除等;另外也可與IgG結合阻止免疫復合物的產生[14]。5個差異蛋白參與了機體免疫反應,提示雞肉不耐受的發生機制可能與免疫、炎癥有關;另外,2個下調蛋白QSOX1和ORM2與免疫的關系還未明確,有待進一步研究。

雞肉中含有豐富的牛磺酸和尼克酸,能夠增加脂質和膽固醇的溶解性,促進脂類在機體的吸收,而脂質代謝對免疫系統和炎癥又有一定的影響[15],抑制炎癥的發生。機體也可能由于缺乏水解某種蛋白質的酶引起一系列的變化,如激活炎癥、免疫調節、凝血等生物學過程,導致雞肉不耐受。通路富集結果顯示,補體系統能夠發揮調節免疫和炎癥等功能;凝血酶能夠將可溶性Fg轉變為纖維蛋白凝塊,進而在穩態和炎癥反應過程中起調節作用,提示雞肉不耐受的發生與機體識別和排除“異己”的生理反應有關。從富集分析結果中解釋了蛋白質的部分生物學功能,還有多種表達不明顯的生物學功能,例如纖溶酶原激活的負調節、防御反應、補體激活、血管生成的正調節等。纖溶酶原活性的負調節與血栓的形成有關,研究表明免疫平衡崩潰也可引起血栓[16];補體的激活可引起一系列的炎癥反應和免疫反應[17]。雖然這些生物學作用在本研究中未明顯表達,但也為探討雞肉不耐受的發生機制提供了一定的潛在依據。

綜上,本研究針對IgG介導的雞肉不耐受患者蛋白表達數據,利用PLS-DA方法,結合蛋白互作分析以及富集分析,識別差異蛋白及其通路。篩選獲得的差異蛋白可能是雞肉不耐受發生的關鍵,生物學和代謝通路提示雞肉不耐受的發生與機體免疫、炎癥等過程有關。本研究為研究IgG介導的雞肉不耐受發生機制提供了依據。