SPOCK2 在泛癌中的預后和免疫治療反應中的潛在價值研究

馮忘憂，姜東伯，徐 盈，李 佳，楊 紅*

1.空軍軍醫大學西京醫院婦產科，陜西 西安710032；2.空軍軍醫大學基礎醫學院，陜西 西安710032

腫瘤的發生往往由多種因素驅動，導致其高度的復雜性和異質性[1]。 傳統的癌癥治療模式，包括放射療法、化學藥物治療或靶向治療，其療效較為有限[2]。免疫檢查點抑制劑（immune checkpoint inhibitors,ICIs）作為一種癌癥免疫療法，改變了癌癥晚期患者的治療方式，這是癌癥治療史上的一場革命[3]。 單一的免疫療法對某些腫瘤患者的治療效果仍有限，研究表明，傳統的治療方法可以影響腫瘤微環境（tumor micro environment, TME），與ICIs 聯合使用具有協同作用[2]。 中醫學是我國傳承數千年的醫學，受到越來越多人的重視，研究表明，中醫藥可以通過重塑免疫細胞平衡及調節免疫檢查點等方式殺傷腫瘤細胞[4]。 因此，中醫藥以其獨特的優勢與免疫治療相輔相成[4]。TME是腫瘤細胞與宿主免疫系統相互作用的主要部位[5]。 越來越多的研究表明，免疫抑制性細胞高浸潤是免疫治療的主要障礙[6]，與不良預后和ICIs耐藥性相關[2]。 相反，免疫激活的特點是高促炎免疫物質浸潤，這往往預示著良好的免疫治療效果[7]。 TME是中醫腫瘤辨證論治的物質基礎，治療實質就是重塑TME。 因此，探索TME 可以成為中醫現代化之路的切入點。例如，研究表明，中藥可以調控程序性死亡蛋白-1（programmed cell death protein-1, PD-1）/程序性死亡蛋白配體-1（programmed death ligand-1,PD-L1）免疫通路及相關細胞因子水平抑制胃癌進展[8]。因此，尋找可能影響TME 組分的關鍵基因至關重要，可以為免疫治療新時代中西醫結合治療腫瘤提供支撐，也為中醫藥的作用機制提供理論基礎和參考方向[8]。近年來，轉錄組學和高通量測序的發展導致越來越多的關鍵驅動基因被發現[9]。 這使得可以在泛癌中分析任何與腫瘤相關的基因，并檢查其與臨床預后以及對免疫微環境的影響。

睪丸蛋白聚糖2（sparc/osteonectin, cwcvandkazallike domains proteoglycan 2, SPOCK2）是基質細胞蛋白家族的一員，在卵巢癌和子宮內膜癌的生長中起著重要作用[10-11]。此外，研究表明，SPOCK2 在肺癌中的表達與免疫浸潤有關，表明SPOCK2 在腫瘤免疫調節中具有重要影響[12]，同時說明SPOCK2 在不同的癌癥中具有不同的功能。目前尚無SPOCK2 與免疫微環境相關性的泛癌分析。 本研究利用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas, TCGA）、臨床蛋白質組學腫瘤分析聯盟（Clinical Proteomic Tumor Analysis Consortium, CPTAC）數據庫及人類蛋白質圖譜（Human Protein Atlas, HPA）數據庫中的腫瘤圖譜對SPOCK2 在泛癌中的預后和免疫治療的價值進行探討。

1 材料與方法

1.1 數據收集

從癌癥基因組學數據分析平臺下載來自TCGA、基因型組織表達數據庫的泛癌數據集，為去除測序深度和基因長度等測序數據的技術偏差，該數據集已經過標準化處理，即將數據后臺沒有處理的原始表達量轉變為每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的RNA 測序片段，進一步從中提取SPOCK2 在各個樣本中的表達數據和相關臨床數據。此外，從既往發表在《細胞》雜志上的TCGA 預后研究中獲取高質量的預后數據集，并排除樣本量＜3 的癌癥類型。

1.2 主要試劑

RNA 提取試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司，批號：MF036-01），反轉錄試劑盒（北京聚合美生物科技有限公司，批號：MF166-plus-01），2X 實時定量PCR 預混液（北京聚合美生物科技有限公司，批號：MF015-505）。

1.3 檢測SPOCK2 的差異表達

使用基因表達譜交互分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis,GEPIA2.0）和腫瘤免疫評估資源庫（Tumor Immune Estimation Resource,TIMER 2.0）評估SPOCK2 信使RNA 的表達[13]。 此外，利用GEPIA2.0 的“病理分期”模塊，獲得了TCGA 腫瘤不同病理階段（Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期）SPOCK2 的表達情況。 最后利用CPTAC 數據庫對SPOCK2 在蛋白水平的表達進行評估，且利用HPA 數據庫對部分腫瘤中的差異表達結果進行初步驗證。

1.4 生存分析

采用Kaplan-Meier 方法分析TCGA 隊列患者的生存期和無進展間隔期（progression-free interval,PFI）。

1.5 基于SPOCK2 相關基因的基因富集分析

基于仙桃平臺，篩選出與SPOCK2 共表達的基因，并使用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Ency lopaedia of Genes and Genomes, KEGG）富集工具[14]進行分析，以獲取SPOCK2 在各種癌癥中的潛在機制。

1.6 免疫浸潤分析

基于桑格數據分析[15]平臺，并通過TIMER2.0、CIBERSORT 算法平臺和微環境細胞群計數器（Microenvironment Cell Populations-counter, MCPcounter）等評估SPOCK2 與腫瘤中免疫浸潤水平的相關性。TIMER2.0 數據庫可以分析TCGA 數據集，其中包含B 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞。 CIBERSORT 使用基因表達譜定義復雜組織中的細胞組成。 MCPcounter 根據基因表達矩陣，計算每個樣本中8種免疫細胞和2 種基質細胞的絕對豐度分數。 根據每種TCGA 腫瘤類型的中間值將患者分為SPOCK2 高表達組和低表達組，以比較免疫細胞浸潤程度。

1.7 免疫組織化學分析

利用HPA 數據庫獲取肝細胞性肝癌（liver hepatocellular carcinoma, LIHC）、甲狀腺癌（thyroid carcinoma,THCA）、皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma,SKCM）、卵巢漿液性囊腺癌（ovarian serous cystadenoma, OV）腫瘤組織與相應的正常組織中SPOCK2表達的免疫組化結果。

1.8 熒光定量PCR 反應

按照RNA 提取試劑盒的操作手冊提取人卵巢正常組織和腫瘤組織的RNA，將總RNA 逆轉錄為cDNA 后配制PCR 反應體系共20 μL，反應過程：95 ℃1 min，40 個循環：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃45 s，35 ℃30 s，95 ℃1 min，60 ℃15 s，98 ℃5 s。SPOCK2 正向序列：5'-ATGGAGGACGAGCAATGGCT-3'，反向序列：5'-TGGGTCGGACGAGGGAAC-3'；βactin 正向序列：5'-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3'，反向序列：5'-TCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3'。 讀取FAM 熒光值。 各樣本以β-actin 為內參計算SPOCK2的表達量。β-actin 引物由上海生工生物工程股份有限公司提供，SPOCK2 引物由北京擎科生物科技股份有限公司提供。

1.9 統計學分析

基于student's 檢驗兩組之間的差異。 P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SPOCK2 的表達在多種腫瘤組織和正常組織中有顯著差異

SPOCK2 在腦低級別膠質瘤（brain lower grade glioma, LGG）、子宮內膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma, UCEC）、乳腺癌（breast carcinoma,BRCA）、食管癌（esophageal carcinoma, ESCA）、胃腺癌（stomach adenocarcinoma, STAD）、頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSC）、LIHC、THCA、SKCM、OV、胰腺腺癌（pancreatic adenocarcinoma, PAAD）、子宮癌肉瘤（uterine carcino sarcoma, UCS）、嗜鉻細胞瘤和副神經節瘤（pheochromocytoma and paraganglioma, PCPG）和膽管細胞癌（cholangiocarcinoma, CHOL）14 種腫瘤表達較高。在多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）、肺腺癌（lung adenocarcinoma, LUAD）、腎乳頭狀細胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma, KIRP）、結腸腺癌（colon adenocarcinoma, COAD）、腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma, KIRC）、肺鱗狀細胞癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）、直腸腺癌（rectum adenocarcinoma, READ）、睪丸生殖細胞瘤（testicular germ cell tumors, TGCT）、急性淋巴細胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）、急性髓系白血病（acute myeloid leukemia, AML）、腎上腺皮質癌（adrenocortical carcinoma, ACC）和腎嫌色細胞癌（kidney chromophobe, KICH）12 種腫瘤中表達較低，詳見圖1A。 通過GEPIA2.0 進一步驗證了其中6 個腫瘤的結果，發現除胸腺癌（thymoma,THYM）外，其余5 種腫瘤的結果均與圖1A 一致，詳見圖1B。使用GEPIA2.0 發現SPOCK2 在THYM中高表達，圖1A 數據所得結果不包含THYM。使用“病理分期”模塊進一步發現在SKCM、THCA、STAD 和KICH 4 種腫瘤中，SPOCK2 的表達在較高的分期顯著升高，詳見圖1C。 此外，HNSC、OV、KIRC、PAAD、GBM 和LUAD 中腫瘤細胞與正常組織的SPOCK2 蛋白水平有顯著差異，詳見圖1D。 以上結果說明在基因水平和蛋白表達水平上，SPOCK2基因在多種腫瘤類型的腫瘤組織中的表達與在正常組織中的表達有顯著差異。 這一發現也表明，SPOCK2基因在表達上調和下調腫瘤中的功能有差異。

圖1 SPOCK2 在泛癌腫瘤組織與正常組織中的差異表達分析

2.2 SPOCK2 高表達在大多數癌癥中與良好的預后相關

根據SPOCK2 表達水平將病例分為高表達組和低表達組，并使用TCGA 數據集檢驗其在不同腫瘤類型中的預后意義。 從Kaplan-Meier 總生存分析結果來看，SPOCK2 是OV 患者的危險因素（P=0.007），是BRCA（P=0.003）、THCA（P=0.021）、口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma, OSCC）（P=0.028）、HNSC（P<0.001）、PAAD（P=0.025）、SKCM（P<0.001）患者的保護因素，詳見圖2A。 PFI 分析結果顯示，SPOCK2 是前列腺癌（prostate adenocarcinoma, PRAD）患 者 的 危 險 因 素（P=0.005），是HNSC（P<0.001）、SKCM（P=0.001）、BRCA（P=0.005）、CHOL（P=0.002）、LIHC（P=0.032）和LGG（P=0.001）患者的保護因素。詳見圖2B。

圖2 SPOCK2 表達與患者預后的關系

2.3 KEGG 富集分析發現SPOCK2 參與免疫相關的通路

使用富集分析方法探討SPOCK2 在PAAD、HNSC、LIHC、LUAD、SKCM、LAML、BRCA、PRAD 和OSCC 9種腫瘤中的功能及其相關通路。 選取每種腫瘤中與SPOCK2 呈正相關的前300 個基因。 KEGG 分析的結果表明SPOCK2 與T 細胞、T 輔助細胞的激活和分化、趨化因子信號通路、T 細胞受體信號通路、細胞因子受體活性、T 細胞受體復合物、淋巴細胞分化和抗原受體介導的信號通路有關，詳見圖3。 T 細胞活化是免疫反應的核心，是抗腫瘤作用的關鍵。 因此，SPOCK2 參與了這些腫瘤中T 細胞的激活和分化，是其對某些腫瘤具有保護作用的重要原因。 這些途徑都與免疫反應和免疫調節過程有關，表明SPOCK2可以調節腫瘤免疫微環境。

圖3 SPOCK2 相關基因的KEGG 富集分析

2.4 SPOCK2 表達水平與免疫浸潤水平相關

進一步分析SPOCK2 與免疫細胞的相關性以明確其免疫學功能。 TIMER2.0 算法分析結果顯示，在大多數腫瘤中，SPOCK2 與B 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞浸潤呈正相關，詳見圖4A，這與MCPcounter 數據庫得到的結果相對一致，詳見圖4B。 雖然，MCPcounter 數據庫算法比TIMER2.0 評估更多的免疫細胞類型，但仍發現SPOCK2 對一些癌癥的免疫細胞浸潤水平影響較小，包括OV、CHOL、ACC、THCA、間皮瘤、LGG、PCPG、GBM、THYM 和UCS，低免疫浸潤提示預后不良。 因此，SPOCK2 可作為OV、UCS、ACC 預后不良的生物學標志物。 利用CIBERSORT 數據庫的免疫細胞浸潤數據共獲得34種腫瘤類型的22 種免疫細胞浸潤評分，詳見圖4C。22 種免疫細胞包括漿細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞，以及各種類型的B 淋巴細胞、T 淋巴細胞、自然殺傷性細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞和肥大細胞。 結果表明，SPOCK2 與靜息B 淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、CD4+T 淋巴細胞、M1 型巨噬細胞呈正相關，而與靜息自然殺傷細胞、M0 型和M2型巨噬細胞、靜息肥大細胞和嗜酸性粒細胞呈負相關。

圖4 免疫細胞浸潤分析

2.5 SPOCK2 在多種腫瘤類型中與免疫檢查點相關基因具有相關性

目前，阻斷免疫檢查點是免疫療法的主要手段，而免疫微環境是影響腫瘤免疫治療的重要因素。 因此進一步探討SPOCK2 是否具有調節免疫微環境的作用，且是否與免疫檢查點相關的基因具有相關性是有必要的。 本文評估了SPOCK2 與五類免疫途徑的相關性，包括趨化因子、受體、主要組織相容性復合體標記基因的表達、免疫抑制因子和免疫刺激因子[16]，詳見圖5A。 SPOCK2 的表達與趨化因子CCL2、CCL4、CCL5 和CCL7 及其受體CCR2、CCR4、CCR5和CCR7 呈正相關。 進一步提取SPOCK2 和包括抑制性和刺激性兩類免疫檢查點通路在內的60 個基因，詳見圖5B。 分析發現，SPOCK2 在大多數腫瘤類型中與衰竭T 細胞標記基因、免疫激活基因和癌癥免疫抑制基因、T 細胞免疫球蛋白免疫受體酪氨酸抑制基序結構、細胞程序性死亡蛋白1（programmed cell death 1, PDCD1）、淋巴細胞活化基因-3、細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA4）、表面抗原分化簇274 等與免疫治療相關的基因具有正相關性。 結果表明，SPOCK2 在TME 中起著至關重要的作用。

圖5 SPOCK2 與免疫調節、免疫檢查點基因的相關性

2.6 免疫組織化學分析

從HPA 數 據 庫LIHC、THCA、SKCM 和OV 腫瘤組織及其相應的正常組織中SPOCK2 的免疫組織化學結果，詳見圖6。這些結果支持TCGA 的發現，即SPOCK2 在LIHC、THCA、SKCM 和OV 組織中的表達高于正常組織。

圖6 免疫組織化學分析SPOCK2 在不同腫瘤組織與正常組織的差異表達

2.7 熒光定量PCR 分析

以上結果均基于數據庫得到，為了進一步驗證SPOCK2 在正常組織和癌癥組織的表達差異，選取正常卵巢上皮組織和OV 組織為代表，經過熒光定量PCR 分析可以發現，OV 組織中SPOCK2 mRNA 的表達水平確實高于正常卵巢上皮組織，與GEPIA2.0和HPA數據庫得到的結果一致，詳見圖7。

圖7 熒光定量PCR 驗證SPOCK2 mRNA 在OV組織中的表達水平（n=3）

3 討論

隨著對腫瘤生物學和免疫學的探索，過去十年ICIs 在腫瘤的臨床治療中取得了重大進展[17]。 由于腫瘤特性極度復雜，免疫治療也存在有效人群比例低、產生耐藥性、過度進展等問題。 只有大約20%的患者可以從ICI 單藥治療中獲益。 近年來中醫藥輔助免疫治療在腫瘤治療中展現出強大的優勢，兩者相輔相承。中醫認為扶正祛邪法是治療腫瘤的關鍵，通過調整陰陽、扶助正氣使機體達到平衡狀態，使患者能夠帶瘤生存。 現代醫學中免疫治療從免疫逃逸機制出發，研發出的ICIs 大大改善腫瘤治療效果，這種利用患者自身免疫功能殺傷腫瘤的治療理念，與中醫扶正抑瘤的理念具有異曲同工之妙[18]。 但無論是傳統中醫還是現代醫學都注重個體化治療，因此，尋找新的生物標志物對幫助臨床醫生預測癌癥的預后和中西醫聯合免疫治療效果至關重要。SPOCK2 在某些腫瘤中可作為幫助診斷的生物標記物。 本研究對SPOCK2 在泛癌中的預后和免疫治療價值進行了系統的分析。

SPOCK2 在14 種腫瘤中高表達，在12 種腫瘤低表達。 HPA 數據庫的免疫組織化學結果也顯示在LIHC、THCA、SKCM 和OV 中SPOCK2 的表達高于正常組織。 且SPOCK2 在大多數具有統計學意義的癌癥中是保護因素，但僅在OV 中是危險因素。之前的研究發現在OV 中，隨著hsa-miR-363-3p-SPOCK2軸的促進，SPOCK2 被下調，它可以調節肌動蛋白細胞骨架，阻斷OV 的分期進展[11]，這與本次研究結果一致。 此外，SPOCK2 的表達與臨床分期相關，提示SPOCK2 在 指 導SKCM、THCA、STAD、KICH 4 種腫瘤不同分期患者的治療方面具有臨床意義。

KEGG 分析發現SPOCK2 與T 細胞和輔助T 細胞的激活和分化有顯著相關。 輔助性T 細胞和功能性T 細胞都在免疫微環境中發揮重要作用。 且在大多數癌癥中，SPOCK2 的表達與發揮主要免疫功能的免疫細胞也密切相關，包括B 淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞、CD8+T 淋巴細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、癌癥相關成纖維細胞、NK 細胞、免疫檢查點和免疫調節相關基因。 這些結果表明，SPOCK2 在調節TME 中起著至關重要的作用。

對 于BRCA、THCA、HNSC、PAAD 和SKCM 來說，SPOCK2 高表達與其瘤內高免疫浸潤水平相關，這也解釋了SPOCK2 在這些腫瘤中起保護作用的現象。 相反，SPOCK2 是OV 和PRAD 的危險因素，雖然該基因在腫瘤中高表達，但其免疫浸潤水平較低。這種情況表明，在免疫抑制的情況下，SPOCK2 的功能受到限制。影響腫瘤微環境的因素很多。例如，腫瘤浸潤的調節性T 細胞可以誘導免疫抑制微環境，這是腫瘤免疫治療成功的主要障礙[19]。因此，當其他抑制因子在免疫微環境中占據優勢時，SPOCK2 的免疫激活功能可能受到限制。

此外，SPOCK2 與PDCD1 和CTLA4 基 因在多種腫瘤里呈正相關，例如在SKCM，READ，LUSC 等腫瘤中，且PD-1 抑制劑和CTLA4 抑制劑均已在臨床廣泛應用，尤其在SKCM 及LUSC 等實體腫瘤中治療效果明顯，表明SPOCK2 可以作為一種生物標志物來指導免疫治療藥物的使用。 本文初步分析了SPOCK2 在泛癌中的作用，發現SPOCK2 與調節免疫微環境的刺激分子及抑制分子相關，具有調節免疫微環境的作用。因此，在某些腫瘤中，可預測免疫治療敏感性。當然，這還需要更深入的研究去驗證。綜上所述，本文評估了SPOCK2 在癌癥中預后和免疫治療反應預測的作用，并發現其在不同的癌癥中發揮不同的功能。 該研究為SPOCK2 在惡性腫瘤中的應用提供了一個新的角度，這有助于科學家尋找更好的治療癌癥患者的方法，也可為中醫藥作用靶點以及分子生物學領域的研究提供參考方向。