六味地黃湯對多囊卵巢綜合征大鼠性激素水平及轉化生長因子β/Smads信號通路相關因子的影響※

袁晨翼 劉美玉 莊庭怡

(天津市中心婦產科醫院中醫科,天津 300199)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是以排卵障礙、高雄激素血癥、月經失調、胰島素抵抗以及不孕等為主要特征的內分泌紊亂綜合征,其發病機制目前仍不明確[1],其卵巢呈多囊性改變、間質增生,在育齡婦女中發病率可達8%～13%[2],嚴重影響患者生活質量、生育及遠期健康[1]。PCOS不孕、不良妊娠結局的概率較高[3]。西醫治療主要以短效避孕藥為主,副作用較多,復發率高。中醫學中并無PCOS的直接論述,根據其癥狀大致屬于“閉經”“月經后期”“崩漏”“不孕”等范疇,現代中醫學者普遍認為腎虛是本病的主要病機[4-5]。《“健康中國2030”規劃綱要》提出應充分發揮中醫藥獨特優勢,并進一步強調了要提高中醫藥服務能力,探索中醫藥在常見病中的優勢作用。近年來,中醫藥經典名方的研究趨于活躍。六味地黃湯作為中醫傳統經典名方,最早記載于宋·錢乙的《小兒藥證直訣》,由金匱腎氣丸化裁而來,全方攻補兼施,適用于腎虛所致的多種疾病,現代臨床將其廣泛用于圍絕經期綜合征、慢性腎病等的治療[6-9]。轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一個包含眾多成員的多功能細胞因子大家族,其通過介導細胞外-細胞膜-細胞內-核內的一系列生物信號傳遞,從而參與細胞的生長、增殖、分化、遷移和凋亡等過程,尤其是TGF-β1已被證實在細胞炎癥、組織纖維化的發生發展過程中發揮關鍵作用[10-13]。Smads蛋白家族是TGF-β1的下游信號分子,在將TGF-β信號從細胞表面受體傳導至細胞核的過程中起關鍵性作用[14-15]。相關研究[4]表明,TGF-β/Smads在PCOS患者中表達異常,但未形成統一認識。本研究通過來曲唑造模法制作PCOS大鼠模型,觀察六味地黃湯對PCOS模型大鼠性激素水平及TGF-β/Smads 信號通路相關因子的影響,以探討六味地黃湯對PCOS大鼠的干預效果及可能的作用通路和靶點,為中醫古方新用提供依據,結果如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 動物 雌性21日齡SD大鼠 20只,體質量(70±20)g,購于斯貝福(北京)生物技術有限公司,實驗動物使用許可證號:SCXK(京)2019-0010,所有大鼠均在動物房中飼養,保持動物房環境及鼠籠清潔、透氣,溫度24～26 ℃,相對濕度55%～60%,自由飲食、飲水,晝夜交替12 h。

1.1.2 實驗藥品 六味地黃湯,藥物組成:熟地黃24 g,山藥12 g,山茱萸12 g,牡丹皮9 g,茯苓9 g,澤瀉 9 g。由天津市中醫藥研究院附屬醫院中藥房提供,并鑒定為道地藥材,置于4 ℃冰箱保存備用。來曲唑(北京凱詩源生物科技有限公司),化學式:1-[雙(4-氰基苯基)甲基]-1,2,4-三氮唑;4,4'-(1 H-1,2,4-三唑-1-基亞甲基)-雙苯腈。炔雌醇環丙孕酮(江蘇恒瑞醫療有限公司,國藥準字J20140114)。1%羧甲基纖維素溶液(CMC)(北京凱詩源生物科技有限公司)。

1.1.3 主要試劑及儀器 雌二醇(E2)、黃體生成激素(LH)、卵泡刺激素(FSH)、睪酮(T)酶聯免疫吸附法(ELISA法)試劑盒,蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒、TGF-β1、Smad3、Smad4及Smad7 抗體(上海通蔚生物科技有限公司),RIPA裂解液(美國Abcam公司),蛋白酶抑制劑混合物[翌圣生物科技(上海)股份有限公司],BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Fisher公司),HRP辣根過氧化物酶標記的二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司),ECL化學發光檢測試劑盒(北京全式金生物技術股份有限公司),5%脫脂奶粉(美國Thermo Fisher公司)。電泳儀及電泳槽 (BIO- RAD),Tanon 4800化學發光凝膠成像系統(上海天能生命科學有限公司),Varioskan LUX多功能酶標儀(美國Thermo Fisher公司),偏光顯微鏡(德國徠卡公司),TS-200雙層數顯脫色搖床 (海門市其林貝爾儀器制造有限公司),Multifuge X1R 臺式冷凍離心機(Thermo Scientific), 100～1000 μL 移液器、10～100 μL移液器、20～200 μL移液器、1～10 μL移液器、30～300 μL移液器(美國Rainin Instrument公司)。

1.1.4 藥物溶液配制 ①來曲唑溶液:來曲唑溶液2.5 mg溶入1% CMC溶液20 mL中配置成濃度為0.125 mg/mL的溶液。②六味地黃湯藥材煎煮按照《中藥湯劑煎煮規范(2021版)》煎煮濃縮至含生藥0.5 g/mL的藥液。③炔雌醇環丙孕酮溶液:炔雌醇環丙孕酮研磨至粉末狀,將1片(約2 mg)的藥物溶于1% CMC溶液100 mL中配制成濃度為0.02 mg/mL的溶液,按人與大鼠公斤體質量折算系數給藥,即10 mL/kg。

1.2 模型建立、分組及給藥 隨機將20只雌性SD大鼠分為空白對照組5只,造模組15只。造模組大鼠稱質量后,予來曲唑溶液8 mL/kg灌胃,每日1次,連續21天。同時空白對照組予等量1% CMC灌胃,每日1次,連續21天。造模成功后將造模組大鼠進一步分為模型組、中藥組、中西醫結合組,每組5只。中藥組大鼠予六味地黃湯生藥7.5 g/(kg·d)灌胃,連續21天;中西醫結合組大鼠在中藥組基礎上予炔雌醇環丙孕酮溶液10 mL/(kg·d)灌胃,六味地黃湯與炔雌醇環丙孕酮溶液間隔30 min灌胃,連續21天;模型組和空白對照組予0.9%氯化鈉注射液7.5 mL/(kg·d)灌胃,連續21天。

1.3 取材及檢測方法

1.3.1 取材 最后一次給藥后次日各組大鼠均股動脈取血5 mL至抗凝管,2000 r/min 離心20 min,分離血清,-20 ℃保存待檢測。然后10%水合氯醛腹腔注射麻醉,剖開腹腔取兩側卵巢置于遇冷磷酸鹽緩沖液(PBS)中,分離脂肪及結締組織,一側固定于4%多聚甲醛中,另一側吸干水分,凍存于-80 ℃備用,用于蛋白免疫印跡(Western blot)檢測。

1.3.2 檢測指標及方法

1.3.2.1 血清性激素測定 采用ELISA法檢測。①取出血清樣本,2～8 ℃融化備用。②標品稀釋:進行對倍稀釋至說明書濃度,LH標品濃度為40、20、10、5、2.5 ng/L,FSH標品濃度為24、12、6、3、1.5 IU/L,E2標品濃度為80、40、20、10、5 ng/L,T標品濃度為8、4、2、1、0.5 nmol/L。③加樣:設置空白孔、標準孔、待測樣品孔。標準品孔加 50 μL,待測樣品孔先加樣品稀釋液40 μL,再加樣品10 μL(樣品最終稀釋度為5倍)。④溫育:封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。⑤洗滌:小心揭掉封板膜,棄去液體,紙巾上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后甩掉,拍干,重復5次操作。⑥加酶:空白孔除外,每孔加入50 μL酶標試劑,37 ℃溫育30 min。⑦洗滌:同操作⑤。⑧顯色:每孔先加入顯色劑A 50 μL,再加入顯色劑 B 50 μL,振蕩混勻,37 ℃避光顯色10 min。⑨終止:每孔加終止液50 μL(此時由藍變黃)。⑩測定:酶標儀在450 nm處測各孔吸光值。

1.3.2.2 Western blot檢測卵巢組織TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達 取各組大鼠卵巢組織,RIPA裂解液提取細胞總蛋白,添加蛋白酶抑制劑混合物。使用BCA蛋白定量試劑盒測定總蛋白含量,取30 μg總蛋白上樣,并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠分離,電轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉30 min后,轉膜后5%脫脂奶粉室溫封閉30 min,4 ℃孵育TGF-β1(1∶2000),Smad3(1∶20 000)、Smad4(1∶2000)、Smad7(1∶1 000)一抗,振搖過夜,HRP辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h,添加ECL化學發光液,Tanon 4800化學發光凝膠成像系統拍照,Image J軟件讀取各條帶灰度值,以各目的條帶/β-actin比值為目的蛋白相對表達量。

1.3.2.3 卵巢組織形態及結構 卵巢組織以4%多聚甲醛固定48 h后脫水切片,脫蠟水化后進行HE染色,并在光學顯微鏡下觀察卵巢的形態及結構。

2 結果

2.1 各組大鼠LH、FSH、E2、T水平比較 與空白對照組比較,模型組LH、T水平升高(P<0.05);與模型組比較,中藥組、中西醫結合組LH、T水平均降低(P<0.05),而中藥組LH、T水平與中西醫結合組比較差異無統計學意義(P>0.05)。4組FSH、E2比較差異均無統計學意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠 LH、FSH、E2、T 水平比較

2.2 各組大鼠卵巢組織TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達比較 與空白對照組比較,模型組TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達水平均升高(P<0.05)。與模型組比較,中藥組TGF-β1、Smad3、Smad4蛋白表達水平均降低(P<0.05),Smad7蛋白表達水平升高(P<0.05),中西醫結合組Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達水平均降低(P<0.05),而TGF-β1蛋白表達水平與模型組比較差異無統計學意義(P>0.05)。與中西醫結合組比較,中藥組TGF-β1蛋白表達水平降低(P<0.05),Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達水平升高(P<0.05)。見表2、圖1。

圖1 各組大鼠卵巢組織TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達條帶圖

表2 各組大鼠卵巢組織 TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達比較

2.3 各組大鼠卵巢組織病理形態 空白對照組大鼠卵巢結構清晰,鏡下可見多個不同發育時期的卵泡及黃體,卵泡壁由多層顆粒細胞組成,顆粒細胞形態完整;模型組可見多個竇卵泡,大鼠卵巢呈多囊樣改變,顆粒細胞排列紊亂,層數減少,卵泡膜細胞明顯增生,間質增厚,未見優勢卵泡;中藥組大鼠竇卵泡數量減少,顆粒細胞層數增多,有優勢卵泡;中西醫結合組可見多個不同發育時期的卵泡,顆粒細胞層數增多,且排列整齊。見圖2。

圖2 各組大鼠卵巢組織病理形態(HE,×200)

3 討論

中醫學理論認為“腎-天癸-沖任-胞宮軸”是維持女性生殖功能的基礎。PCOS作為一組內分泌代謝疾病,在育齡期主要表現為月經失調及不孕。《素問·上古天真論》載:“女子……二七而天癸至,任脈通,太沖脈盛,月事以時下,故有子。”《素問·奇病論》云“胞絡者,系于腎”。《馮氏錦囊秘錄》中載“腎氣全盛,沖任流通,經血漸盈,應時而下,天真之氣降,與之從事,故云天癸也”。《質疑錄》中載“天癸者,天一所生之真水,在人身是謂元陰”。綜上可見,腎氣腎精的充盛與月經的發生、生殖孕子關系密切,腎虛精虧,則天癸枯竭,沖任虧虛,經血無源,致月經失調甚至閉經;腎陰虛損,天癸乏源,血海失充,胞宮失養而不孕。故本研究認為PCOS與腎虛密切相關。王旭東等[4]也指出腎虛是PCOS發病的基本病機。根據治病求本的治療原則,以補腎為主要治療大法,故本研究選用中醫經典補腎方劑六味地黃湯,方中熟地黃為君藥,重用以填精益髓滋陰。山茱萸補肝益腎澀精,山藥補脾益腎,二者共為臣藥,君臣相佐,肝、脾、腎同補,即所謂“三補”。又以澤瀉泄濁利濕,并防熟地黃滋膩;以茯苓健脾祛濕,并助山藥補益脾胃;以牡丹皮清瀉相火,并制山茱萸溫澀。此三味藥合用,清火泄濁祛濕,即所謂“三瀉”,共為佐藥。全方補瀉兼施,共奏滋陰補腎之功。

PCOS性激素變化特點為LH升高、LH/FSH比值異常,常合并高雄激素血癥、高胰島素血癥等。本研究結果顯示,與空白對照組比較,模型組LH、T水平升高,卵巢呈現典型的PCOS相關改變,提示來曲唑造模法是成熟可行的大鼠PCOS模型造模方法。經六味地黃湯、六味地黃湯+炔雌醇環丙孕酮干預后的PCOS大鼠血清LH、T水平均較模型組下降(P<0.05),且2組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。可見六味地黃湯聯合或不聯合炔雌醇環丙孕酮均可改善PCOS大鼠性激素水平。

PCOS卵巢的表現為卵巢中心間質增生,伴有周圍大量的小竇卵泡而缺乏優勢卵泡。早期卵泡發育、閉鎖的調控的具體過程仍不清楚。TGF-β/Smads信號轉導通路是典型的跨膜轉導通路,該通路通過一組配體與受體結合,將細胞外的信號轉導入細胞內,激活下游的Smad蛋白、轉錄調節靶基因,從而介導配體對細胞的生物學作用。TGF-β/Smads信號通路對卵巢發育的調控機制已成為生殖生理學領域研究熱點之一,其以自分泌和(或)旁分泌等方式調控顆粒細胞、增殖和卵母細胞生長,影響著卵巢發育[16]。王春霞等[17]研究指出上調Smad3、Smad4表達可促進卵泡生長發育。劉龍陽等[18]研究指出卵巢局部的TGF-β水平異常可導致卵泡發育異常和排卵障礙。也有研究證實[19],TGF-β/Smads 信號通路在卵巢纖維化方面起著重要作用。由此可知,TGF-β/Smads信號通路能影響卵泡的生長發育,但同樣也能導致卵泡過度增殖及卵巢纖維化。PCOS主要以大量竇卵泡發育而無優勢卵泡及卵巢纖維化為病理改變。本研究中,模型組TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達水平均高于空白對照組,TGF-β1、Smad3、Smad4的升高考慮與PCOS卵巢炎癥反應、間質增生、卵泡過度發育相關。Smad7作為抑制型Smad主要起抑制信號轉導的作用[20],本研究中模型組Smad7表達水平高于空白對照組,考慮可能與信號通路負反饋調節相關,有待于進一步研究證實。本研究結果已經顯示出TGF-β/Smads信號通路相關因子在PCOS發生發展中似乎確實發揮著重要的作用。在本研究中,與模型組相比,六味地黃湯干預可降低TGF-β1、Smad3、Smad4表達水平,升高Smad7表達水平,表明六味地黃湯可能是通過調節TGF-β/Smads信號通路相關因子表達,從而發揮治療PCOS的作用。此外本研究中中西醫結合組TGF-β1蛋白表達水平較模型組無明顯變化(P>0.05),而Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達水平較模型組降低(P<0.05),可見六味地黃湯聯合炔雌醇環丙孕酮對TGF-β/Smads相關因子的影響并未顯示出一致性,可能主要與本研究樣本量較少相關,有待于進一步研究探討。同時,與中西醫結合組比較,中藥組TGF-β1蛋白表達水平降低(P<0.05),Smad3、Smad4、Smad7蛋白表達水平升高(P<0.05)。提示單純六味地黃湯干預較六味地黃湯聯合炔雌醇環丙孕酮干預對TGF-β/Smads通路的抑制作用更強,且主要可能與通過上調抑制型Smad7水平相關。

綜上所述,六味地黃湯、六味地黃湯聯合炔雌醇環丙孕酮均能改善PCOS大鼠的性激素水平。TGF-β/Smads過度表達似乎是PCOS的發病的內在機制之一,而六味地黃湯能調節TGF-β/Smads信號通路相關因子的表達,主要是通過上調抑制型Smad7水平發揮作用,而本研究中關于六味地黃湯聯合炔雌醇環丙孕酮對TGF-β/Smads相關因子的表達并沒有顯示出一致性,且研究樣本量較少,尚不能完全解釋TGF-β1、Smad3、Smad4、Smad7相關因子的變化趨勢,有待于進一步研究證實。