濃縮生長因子促進大鼠下頜骨聯合部成骨作用的初步研究

盧 鵬,陳祉宏,楊月美,尹忠浩,吳福麗,宋曉萌,吳煜農

濃縮生長因子(concentrated growth factor,CGF)是通過差速離心得到的最新一代血小板濃縮物,幾乎含有離心血液內全部的生長因子[1-3]。與一代血小板濃縮物——富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)相比,不需添加凝血酶,避免了引起患者的過敏及排異反應的可能性;與二代血小板濃縮物——富血小板纖維蛋白(platelet rich fibrin,PRF)相比,CGF具有更加致密的網格結構[4],其緩慢釋放生長因子的過程更接近組織愈合的自然過程[5-6]。CGF取材方便,制備簡單、高效,并具有一定的抗炎作用,已經在口腔種植領域廣泛應用[7-10];但是,影響其促進骨組織愈合的具體因素尚未完全清楚,是否單獨或聯合其他生物材料應用于骨組織缺損處,尚未達成共識[11]。

骨缺損的實驗模型包括部分骨缺損、節段骨缺損、骨鉆孔缺損等[12]。然而在不使用任何材料填充缺損的情況下,這些骨缺損也可以進行一定程度的自我修復[13]。如果我們有一個非手術制造缺損的骨缺損模型,那么這個模型就可以更好地避免骨組織自我修復帶來的觀測上的干擾。

大鼠下頜骨由兩塊骨塊構成,其間的下頜骨聯合由纖維結締組織連接[14]。因為該聯合處生理情況下不會閉合,所以可作為一種先天性骨缺損模型[15]。在本研究中,我們按分組將CGF和成骨材料填入大鼠下頜骨聯合中,并觀察該天然缺損是否生成新的骨組織,使缺損愈合。成骨結果通過顯微計算機斷層掃描(micro-CT)和組織學進行評估。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雌性SD大鼠24只,4周齡,體重90～110 g,由南京醫科大學實驗動物中心提供。動物生產許可證號:SCXK(浙)2019-0001。動物倫理審查編號:IACUC-2011044。

1.1.2 設備與試劑 Geistlich Bio-Oss膠原骨,注冊證編號:國械注進20153460268(Geistlich Pharma AG瑞士蓋氏制藥有限公司);TR18 CGF血纖維蛋白離心機(江蘇創英醫療器械有限公司);micro-CT(skyscan 1172,比利時)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組手術及取材 SD大鼠隨機分為3組,每組8只。第1組,膠原骨組;第2組,CGF+膠原骨組;第3組,CGF組。在第3、6個月分兩批處死動物,并處理解剖獲取大鼠下頜骨。

1.2.2 建立大鼠下頜骨聯合缺損模型 ①大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉,然后將大鼠仰臥位固定,頜下備皮,消毒鋪巾。②沿下頜骨邊緣設計10 mm長新月形的切口。③切開并分離皮膚,充分暴露骨膜。④切開骨膜至骨面,剝離子鈍性剝起骨膜,暴露大鼠左右下頜骨間纖維結締組織(圖1A)。⑤刮除雙側下頜骨間纖維結締組織(圖1B)。⑥加入填充材料(圖1C、D)。⑦縫合骨膜(圖1E)。⑧檢查口內是否與下頜骨聯合相通(圖1F)。⑨縫合皮膚。

A:切開皮膚及皮下組織;B:剝離骨膜并刮除雙側下頜骨間結締組織;C:于缺損處填入膠原骨(箭頭示);D:于缺損處填入CGF(箭頭示);E:縫合骨膜瓣;F:檢查口內未穿通

1.2.3 CGF的制備 采用真空采血管從大鼠頸靜脈抽取靜脈血3 mL,置于TR18 CGF血纖維蛋白離心機,變速離心13 min后,可見采血管中分為三層:最上層的血漿層,中間的CGF層和最下方的紅細胞層(圖2A)。倒出上清液后,采用無菌鑷子夾出CGF和下方的紅細胞凝塊,剪除凝塊后得到的黃色膠凍樣物質即為CGF凝膠(圖2B)。

A:采血管中分為三層,最上層的血漿層、中間的 CGF 層和最下方的紅細胞層;B:黃色膠凍樣物質即為CGF

1.2.4 micro-CT分析放射學骨愈合及骨密度情況 采集的大鼠下頜骨使用skyscan 1172 micro-CT進行分析。使用以下參數:電壓為55 kVp;電流72 μA;每隔15.6 μm對下頜骨進行掃描。使用CTVox軟件(Bruker,Konitch,比利時)生成掃描樣品的3D模型。獲得的3D圖像用于下頜骨聯合愈合的放射學檢查。使用放射學愈合量表對圖像進行評估,0分:無明顯新骨形成;1分:沿下頜骨聯合邊緣皮質骨增厚;2分:較多新骨生成伴明顯的間隙;3分:骨完全愈合或僅伴有微小裂縫。為每個樣本的下頜骨聯合部中線處選擇ROI區域,計算骨密度(bone mineral density)和BV/TV值。

1.2.5 組織學分析組織學骨愈合情況 micro-CT拍攝后,將所有樣本固定在4%多聚甲醛溶液中48 h。沖洗后脫鈣處理,包埋制作組織學切片。HE染色后,組織學切片采用Salkeld等報告的原始量表進行評估,評分0分:纖維愈合伴微量新軟骨/骨形成;1分:纖維愈合伴少量新軟骨/骨形成;2分:由軟骨愈合;3分:骨完全愈合。

1.3 統計學分析

使用Graphpad Pism 9.5軟件進行統計分析。計量資料用均數±標準差表示,多組比較采用單因素方差分析。P<0.05表明結果有統計學差異。

2 結 果

2.1 大體觀察

解剖觀察大鼠下頜骨聯合處成骨情況。CGF+膠原骨組第3個月時于大鼠下頜骨聯合處可探及部分硬組織,但并未連續(圖3A),第6個月時,可見大鼠下頜骨聯合處已基本由新骨連接,探針探診可見硬組織(圖3B);CGF組第3個月時,大鼠下頜骨聯合處僅可見結締組織,探診未及硬組織(圖3C),第6個月時同樣未能探及硬組織(圖3D);膠原骨組第3個月時,于大鼠下頜骨聯合處可探及顆粒狀硬物(圖3E),第6個月時,可及少量光滑硬組織,但并未連續(圖3F)。

A:CGF+膠原骨組第3個月時;B:CGF+膠原骨組第6個月時;C:CGF組第3個月時;D:CGF組第6個月時;E:膠原骨組第3個月時;F:膠原骨組第6個月時

2.2 micro-CT分析

植入材料后第3、第6個月,分兩批處死大鼠,每批每組各4只,取材后進行micro-CT掃描評估大鼠下頜骨聯合處骨量及形態變化。第3個月時,CGF+膠原骨組標本顯示在下頜骨聯合處有大量骨形成,但伴有較為明顯的間隙(圖4A);CGF組(圖4B)和膠原骨(圖4C)組則僅有少量的新骨生成,主要表現為下頜骨邊界的皮質骨增厚。第6個月時,CGF+膠原骨組標本則主要表現為完全的骨愈合,僅伴有微小裂紋,同時較第3個月時,新生成的骨表面更為光滑,與周圍原有下頜骨結合更為協調(圖4D);膠原骨組(圖4E)和CGF組(圖4F)除少數標本表現為較多新骨生成伴有較明顯的間隙,依然僅有下頜骨邊界的皮質骨增厚。通過既定標準對每個標本進行打分(表1),并對各組評分進行統計學分析。

表1 各組大鼠放射學成骨評分

A:第3個月時,CGF+膠原骨組可見大量骨形成,但伴有較為明顯的間隙;B:第3個月時,CGF組僅有少量的新骨生成,主要表現為下頜骨邊界的皮質骨增厚;C:第3個月時,膠原骨組可見少量新骨;D:第6個月時,CGF+膠原骨組為完全的骨愈合,僅伴有微小裂紋,同時表面更為光整;E:第6個月時,膠原骨組為較多新骨生成伴有較為明顯的間隙;F:第6個月時,CGF組僅有骨質增多

進行統計學分析可知,第3個月時,CGF+膠原骨組評分要明顯高于CGF組和膠原骨組(P=0.026 6,P=0.026 6),而CGF組和膠原骨組間并無統計學差異;第6個月時,CGF+膠原骨組評分與CGF組和膠原骨組相比,具有顯著優勢(P=0.002 1,P=0.010 1),而膠原骨組評分看似優于CGF組,卻并無統計學差異(圖5)。

A:第3個月時,各組得分分析;B:第6個月時,各組得分分析;*:P<0.05,**:P<0.01,ns:無明顯差異

將樣本的成骨區域設定為ROI(region of interest)區域,對其進行逐個分析(表2)。結果顯示第3個月時,CGF+膠原骨組骨密度(BMD)顯著高于CGF組(P=0.003 4),但與膠原骨組相比差異無統計學意義(P=0.074 7);而第6個月,CGF+膠原骨組BMD較CGF、膠原骨兩組皆有顯著差異(P=0.000 9,P=0.043 8)。在micro-CT分析中,BV/TV表示骨組織體積與組織體積比值,可直接反映骨量變化情況,比較ROI區域內各組骨組織體積占比(表3)。第3個月時,CGF+膠原骨組BV/TV明顯優于CGF組和膠原骨組(P=0.001 4,P=0.014 7)。第6個月時,CGF+膠原骨組BV/TV同樣優于CGF組和膠原骨組(P=0.000 2,P=0.001 9)。

表2 各組BMD值

表3 各組BV/TV值

2.3 組織學觀察

通過HE染色發現, 其中第3個月時, CGF+膠原骨組(圖6A)顯示雙側下頜骨表面有新生成的骨,但并未接續,其間充滿纖維結締組織,周圍分布有膠原骨中所含多孔骨顆粒,經Masson染色可發現中間區域為纖維結締組織,而非新生骨組織(圖6B);第6個月時,CGF+膠原骨組(圖6C)可見雙側下頜骨間由新生成的骨組織連續,其中可見成骨細胞,Masson染色證實中間部分為骨組織(圖6D)。第3個月時,CGF組可見少量骨質增厚(圖6E),Masson染色表明中間仍為纖維結締組織(圖6F);第6個月時,CGF組可見較多骨質增厚(圖6G),但Masson染色表明主要為纖維結締組織(圖6H)。第3個月時,膠原骨組表現為少量骨質增厚及大量骨粉顆粒(圖6I),Masson染色證實了這一點(圖6J);第6個月時,膠原骨組表現為較多骨質生成,但并未連續(圖6K),Masson染色表明除邊緣增厚的骨質外,主要為纖維結締組織(圖6L)。

A:第3個月時,CGF+膠原骨組HE染色;B:第3個月時,CGF+膠原骨組Masson染色;C:第6個月時,CGF+膠原骨組HE染色;D:第6個月時,CGF+膠原骨組Masson染色;E:第3個月時,CGF組HE染色;F:第3個月時,CGF組Masson染色;G:第6個月時,CGF組HE染色;H:第6個月時,CGF組Masson染色;I:第3個月時,膠原骨組HE染色;J:第3個月時,膠原骨組Masson染色;K:第6個月時,膠原骨組HE染色;L:第6個月時,膠原骨組Masson染色

在CGF+膠原骨組標本中,在新生骨中可見大量血管組織,血供豐富;箭頭所示區域骨質的結構呈板層狀,為骨板結構,該處骨強度較高;五角星所示區域可見到矮柱狀單層排列并與相鄰細胞突起相連的成骨細胞(圖7)。

A:大鼠下頜骨HE染色( ×5);B:大鼠下頜骨HE染色( ×10);箭頭:板層骨;五角星:成骨細胞

CGF+膠原骨組在第3個月時評分顯著優于CGF組和膠原骨組(P=0.003 8,P=0.003 8),而CGF組和膠原骨組間并無統計學差異;第6個月時,與CGF組和膠原骨組相比,CGF+膠原骨組評分依然具有顯著優勢(P=0.008 2,P=0.019 4),膠原骨組評分略微高于CGF組,然而在統計學分析上并無顯著差異(圖8)。

A:第3個月時,各組HE染色比較;C:第6個月時,各組HE染色比較;*:P<0.05,**:P<0.01,ns:無明顯差異

3 討 論

CGF作為新一代血液提取物,含有高濃度的生長因子,如轉化生長因子(transforming growth factor, TGF)、血小板生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)等[2]。它們對骨組織的形成至關重要。Pang等[16]證實BMP-2信號通路的激活可以促進人成骨細胞的增殖和分化。Rochira特別研究了CGF體外誘導人骨髓間充質干細胞(human bone marrow mesenchymal stem cell, hBMSC)成骨分化的能力,證實了單獨使用CGF可誘導hBMSC成骨分化。其他一些體內、體外研究也證實,CGF可誘導成骨細胞分化[17-18],促進新骨形成。CGF具有強纖維蛋白凝膠結構,類似于天然的血凝塊。CGF在應用后不會迅速溶解,在一些相關研究中發現,CGF在第一階段即應用后24 h內釋放生長因子的主要來源于活化的血小板;第二階段的釋放高峰發生在14～28 d[19],可能是來自CGF中的纖維蛋白結構降解和白細胞產生的生長因子[20]。有研究觀察了CGF膜的微觀結構,并評價其作為rhBMP-2在裸鼠皮下組織傳遞支架的能力[21]。證明CGF膜可作為rhBMP-2的短期生物支架。因此,CGF提供了較高濃度的生長因子并可持續釋放,促進了細胞增殖和成骨分化,同時還有一定的成骨支架作用。

在本研究中,CGF+膠原骨聯合成骨效果最好,在成骨量和骨結構重建方面均優于其他各組。這可能是因為膠原骨為早期成骨細胞的附著提供了可靠的支架;CGF可在術后早期釋放生長因子,促進成骨細胞的分化和增殖[17]。中后期,CGF凝膠被吸收到骨顆粒中,血管組織形成增多,局部血管化增強,營養供應增加,骨修復和再生過程中受各種生長因子調節,骨組織形成增多。這也與HE染色切片觀察到的結果一致。而CGF組也有一定的新骨生成,但其單獨填充的骨缺損區未觀察到足夠數量的新骨組織,其原因可能是成骨細胞的增殖分化需要復雜的微環境,受多種生長因子和途徑的調控。雖然CGF可以起到短期支架的作用,同時其生長因子的釋放可達14～21 d,但在漫長的成骨過程中仍是相對較短的。另一個可能的原因是受限骨缺損面積較大,成骨細胞無法得到支架材料的支撐。缺乏穩定的骨分化誘導環境導致缺損中心區域僅有少量骨形成,而大部分被纖維組織覆蓋。

1986年Schmitz等[22]首次提出了臨界性骨缺損的概念,并將其定義為缺損后不做任何處理無法自愈的最小骨缺損尺寸。對于臨界骨缺損尺寸的大小,還未完全達成一致[12],同時在許多實驗中,即使是達到臨界尺寸,不做任何處理在缺損邊緣依然會有新生骨質,這就對實驗構成了干擾。而大鼠下頜骨的缺損是天然的,終身不愈的,很好地避免了這一問題[13,15]。大鼠下頜骨聯合部骨缺損模型具有其獨到之處,其雙側皆為皮質骨,可以更好地模擬一些臨床中遇到的問題,如牙槽突裂等。

本實驗也有一些缺點,大鼠骨骼系統更為原始,該系統不具有哈弗斯系統管式的皮質重塑,反映的成骨情況與人類有一定的不同[23];在手術中,并未于雙側下頜骨表面制作滋養孔,這可能影響了實驗區的血供及成骨、破骨細胞的來源;術后沒有采用合適的方法將大鼠雙側下頜骨進行固定,雖術后采用軟食喂養減少下頜骨受力,但雙側下頜骨間仍有一定動度,不能提供足夠穩定的環境,這使得自兩側增厚新生成的骨質較難在中間區域愈合,同時術后的取材過程也可能對成骨區域造成一定損傷。在以往的實驗中,往往選擇觀測手術后8周[14]和12周[4]時的成骨情況,在我們的預實驗中發現,12周時已可觀測到較為明顯的差異性,同時考慮膠原骨作為成骨支架可長時間留存,為了進一步觀測遠期差異性,選取了術后第3、6個月兩個時間節點。

綜上所述,在第3、6個月時,CGF+膠原骨組在放射學及組織學成骨上,較CGF組和膠原骨組都有更好的表現,而單獨應用CGF較單獨應用膠原骨并無優勢。通過實驗,我們認為CGF含有多種生長因子,可促進骨生成。CGF與膠原骨聯合使用可以明顯促進骨缺損的修復,但單獨使用CGF對骨缺損的效果并不理想。