一種固有抗菌的黏附性可注射水凝膠用于牙周炎骨缺損治療的初步研究

趙潔晨,任 樂,魏 玉,易紫媚,林淑賢,吳珺華

牙周炎是一種微生物和宿主免疫系統之間相互作用引起的慢性炎癥性疾病,其對牙齒支持結構造成持續性不可逆轉的破壞,是牙齒缺失的首要原因[1]。使用含有抗菌劑的局部給藥系統是一種重要的牙周炎輔助治療手段[2]。作為藥物載體的可注射水凝膠由于能注射到不規則的牙周袋內,可保證藥物分布均勻,作用時間延長,且具有成本低、生物相容性高等優點,近年來備受關注[3]。但口腔內的潮濕環境及日常咀嚼吞咽等活動常常會導致水凝膠的降解和脫落,使其難以在牙周袋內長時間存留且持續釋放有效濃度的藥物[4-5]。此外,通過物理相互作用,負載在水凝膠中的藥物多會發生突釋[6],降低了藥物的作用時間和效果,且細菌對傳統抗生素產生耐藥性也已成為一個亟待解決的問題[7]。

ε-聚賴氨酸(Polylysine,PLL)是一種由微生物產生的天然均聚酰胺聚合物,由25～30個賴氨酸殘基組成,對革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及真菌都具有廣譜抗菌活性[8]。聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)由于其良好的生物相容性、代謝性以及組織黏附性,近年來被廣泛用于制備各種生物材料。PEG基水凝膠通常是基于多臂PEG而開發的[9],因此,本研究擬采用PEG衍生物四臂聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸酯(4-arm-PEG-SG)和PLL中的氨基發生酰胺化交聯形成水凝膠。一方面,4-arm-PEG-SG末端活性酯能與牙周組織的氨基反應,產生強黏附力使水凝膠固定于牙周袋內延長存留時間;另一方面,PLL中游離的賴氨酸殘基中的氨基在水凝膠表面產生高密度陽離子表面,形成永久非浸出性殺菌層,從而起到長效殺滅牙周致病菌的作用[10-11]。構建具有固有抗菌黏附性可注射水凝膠可為牙周炎治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設備

ε-聚賴氨酸(南京軒凱生物科技股份有限公司,中國),4-arm PEG-SG(SINOPEG,中國),牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)(北納生物,中國),厭氧基礎瓊脂、厭氧基礎肉湯(Oxoid,美國),無菌脫纖維羊血(新銳生物,中國),胎牛血清(BI,美國),青-鏈霉素、α-MEM、磷酸鹽緩沖液(Hyclone,美國),CCK-8試劑盒(碧云天,中國),Wistar雄性大鼠(上海雷報生物科技有限公司,中國)。

多功能酶標儀(BioTek,美國),渦旋振蕩器、紅外光譜儀(Thermo,美國),純水儀(ELGA,英國),掃描電子顯微鏡(HITACHI,日本),拉力試驗機(GOTECH,中國)。

1.2 方法

1.2.1 PEG-PLL水凝膠制備

使用0.1 mol/L PBS7.4緩沖液配制20、40、60、80 mg/mL不同濃度的PLL溶液。使用純化水配制200 mg/mL的4-arm-PEG-SG溶液。按照1∶1體積比混合,渦旋儀混合均勻,分別得到樣品PEG-PLL-10、PEG-PLL-20、PEG-PLL-30、PEG-PLL-40(PEG-PLL-X,其中X表示PLL的濃度,即PEG-PLL-10表明凝膠中PLL濃度為10 mg/mL)。

1.2.2 PEG-PLL水凝膠的表征測試

1.2.2.1 傅里葉變換紅外光譜學(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)分析 使用溴化鉀壓片法制備紅外樣品,測試波數為4 000～400 cm-1,采集樣品的吸收光譜。

1.2.2.2 凝膠化時間測定 采用倒置法測試凝膠化時間:從4-arm-PEG-SG與PLL溶液混合時開始計時,直到凝膠倒置不流動所需時間為凝膠化時間。每組測試設置3個樣本。

1.2.2.3 吸水溶脹性能測試 將制備的凝膠稱重記為Wi,浸泡于37 ℃的PBS中,定時擦干表面水分后稱重,記為Wt。每隔24 h更換1次PBS,凝膠的溶脹率(%)=(Wt-Wi)/Wi×100%。

1.2.2.4 力學性能檢測 將PEG-PLL凝膠制備成直徑10 mm,高度6 mm的圓柱體,通過拉力實驗機,以1 mm/min的速度進行壓縮實驗,作壓縮強度-壓縮率曲線,并通過15%～25%線性變形區間計算壓縮模量。

1.2.2.5 形貌觀察 樣品通過冷凍干燥法凍干樣品,取內部截面,噴金后上樣觀察水凝膠內部結構。

1.2.3 PEG-PLL水凝膠細胞毒性檢測

根據ISO標準(ISO 10993-5)使用水凝膠浸提液評估細胞毒性。首先將無菌水凝膠(凝膠前體溶液用0.22 μm濾器過濾)浸入α-MEM中,以100 mg/mL的浸提比例在37 ℃恒溫箱中放置24 h,離心得到的上清液即為浸提液。將人牙周膜成纖維細胞(human periodontal ligament fibroblasts,hPDLCs)以5 000個/孔密度接種于96孔板,每組設5個復孔,培養24 h細胞貼壁后將培養基更換為含10% FBS的浸提液,以培養在普通生長培養基中的細胞作為對照組。CCK-8試劑盒根據制造商的說明分別在第1、3天使用。按CCK-8試劑與α-MEM培養基體積比1∶10的比例配置CCK-8工作液,每孔100 μL。在細胞培養箱中避光孵育2 h后,使用酶標儀測量450 nm處測定吸光度。

1.2.4 PEG-PLL水凝膠抗菌性能檢測

使用P.gingivalis測定水凝膠的抗菌性能。將水凝膠前體溶液用0.22 μm濾器過濾后,在96孔板底部原位形成100 μL水凝膠,加入PBS(pH=7.4)沖洗3遍洗去未反應前體材料。然后在水凝膠表面加入濃度為1×106CFU/mL 的100 μL細菌懸液并以不含水凝膠組作為對照。每組重復3次,在37 ℃的厭氧培養箱中培養24 h。然后取出細菌懸液60 μL于新的96孔板內,測量菌液的OD600值。將菌液梯度稀釋一定倍數后,取100 μL稀釋后的菌液,接種于厭氧基礎血平板,培養3 d,對平板上的菌落觀察計數。

抗菌率=(對照組細菌濃度-水凝膠組細菌濃度)/對照組細菌濃度×100%。

1.2.5 PEG-PLL水凝膠體外黏附實驗測定

將新鮮豬牙齦切成1 cm×2 cm大小,在其中一塊牙齦上加入50 μL水凝膠,接著將另一塊牙齦按壓在其上方,保證兩塊黏合牙齦組織的重疊區域為1 cm×1 cm。30 min后將黏合組織置于拉力實驗機下,以1 mm/min速度進行拉伸實驗,直至出現斷裂,從而得到最大黏附強度。為模擬生理環境,黏附實驗中使用的牙齦組織在整個過程中保持濕潤。每組重復3次。

最大黏附強度=斷裂拉伸力值/有效接觸面積。

1.2.6 PEG-PLL水凝膠治療牙周炎的體內實驗

1.2.6.1 構建動物模型 將大鼠隨機分為3組,分別為空白組、單純牙周炎組、牙周炎+PEG-PLL-20水凝膠組,每組5只。4-0#縫合線浸泡P.gingivalis菌液后,繞大鼠上頜第二磨牙牙頸部2周,并在頰側打結,每3 d檢查縫線是否脫落;正常飲食飼養4周,建立牙周炎大鼠模型。4周后拆除上頜結扎絲線,分別在不同組別上頜第二磨牙牙周袋內注射生理鹽水、PEG-PLL-20水凝膠10 μL,未作任何處理者作為空白對照組。每隔1周重復上述操作1次,4周后全麻狀態心臟灌流,取大鼠雙側上頜骨4%多聚甲醛溶液固定24 h。所有操作均符合同濟大學附屬口腔醫院實驗動物倫理要求。

1.2.6.2 Micro-CT分析 使用Micro-CT對上頜骨游離標本進行掃描,掃描條件:70 kVP,精度14 μm。重建大鼠上頜骨,運用Image J軟件分別于近中、中點及遠中測量第二磨牙頰、腭側釉牙骨質界到牙槽嵴頂(cemental enamel junction-alveolar bone crest,CEJ-ABC)的距離。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0與GraphPad Prism 8.0軟件進行統計分析。使用t檢驗和單因素方差分析對實驗結果進行統計,以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PEG-PLL水凝膠表征

2.1.1 FTIR分析

圖1 4-arm-PEG-SG、PLL、PEG-PLL的FTIR紅外光譜

2.1.2 PEG-PLL水凝膠凝膠化時間

4-arm-PEG-SG與PLL混合后,能在30 s之內發生凝膠化,凝膠化時間隨著PLL含量的提高,無顯著性變化(圖2)。

2.1.3 PEG-PLL水凝膠溶脹率

PEG-PLL-10隨著溶脹時間的延長,質量呈下降趨勢,但是質量變化范圍在10%以內。隨著PLL加入量的提高,凝膠的吸水溶脹能力明顯提高,由PEG-PLL-20約10%的溶脹率提高至PEG-PLL-40約60%的溶脹率(圖3)。

圖3 PEG-PLL水凝膠在PBS中溶脹率

2.1.4 PEG-PLL水凝膠力學性能

當PLL濃度在10 mg/mL時,PEG-PLL的壓縮模量為237 kPa,當PLL濃度在20 mg/mL時,其壓縮模量為263 kPa。而當PLL濃度進一步提高時,凝膠的壓縮模量顯著性下降(圖4),與此同時,斷裂壓縮率與斷裂壓縮強度有所提高(圖5)。表明PLL濃度的變化對于可以調控凝膠的力學性質。

與對照組相比,**:P<0.01

圖5 壓縮強度-壓縮率曲線

2.1.5 掃描電鏡表征水凝膠內部結構

PEG-PLL內部為貫穿的多孔結構,孔徑在50～200 μm(圖6)。隨著PLL濃度的提高,PEG-PLL的孔徑變化無明顯差異(圖7)。

圖7 水凝膠孔徑

2.2 PEG-PLL水凝膠的細胞毒性

與對照組相比,PEG-PLL-10和PEG-PLL-20水凝膠組第1、3天均沒有表現出明顯的細胞毒性,而PEG-PLL-30和PEG-PLL-40水凝膠組在第3天時表現出一定的細胞毒性,且隨著PLL濃度增高,細胞活力越低(圖8)。

與對照組相比,*表示P<0.05,**表示P<0.01

2.3 PEG-PLL水凝膠抗菌性能

相較于對照組,隨著水凝膠中PLL濃度升高,OD600值逐漸降低(圖9)。P.gingivalis平板菌落培養計數隨PLL濃度增加而減少,呈現相同的濃度依賴性。對于菌落數計算抗菌率的統計分析結果如圖10、11所示,PEG-PLL-20的抗菌率已超過90%。

**:P<0.01

*:P<0.05,**:P<0.01

圖11 P.gingivalis平板菌落培養

2.4 PEG-PLL水凝膠組織黏附特性

各組PEG-PLL的黏附強度在10～20 kPa,隨著PLL濃度的提高,其黏附強度無顯著性改變,表明PEG-PLL凝膠性質的變化對于整體的黏附強度影響不大(圖12)。

A:使用豬牙齦組織進行搭接剪切黏附強度測試的代表性圖像,紅框代表豬牙齦取材部位,藍框代表黏附范圍;B:各組PEG-PLL水凝膠對豬牙齦的黏附強度

2.5 PEG-PLL-GA水凝膠治療大鼠牙周炎的Micro-CT分析結果

治療4周后Micro-CT掃描結果如圖13所示,相較于空白組,牙周炎組第二磨牙牙槽骨明顯吸收,呈凹坑狀,根分叉暴露,表明牙周炎模型建立成功;使用PEG-PLL-20水凝膠治療后,大鼠牙槽骨破壞情況明顯好轉,牙周炎得到控制。CEJ-ABC距離結果所示,PEG-PLL-20水凝膠處理后CEJ-ABC平均距離較牙周炎組明顯減少(圖14)。

圖13 Micro-CT重建結果

與空白組相比,**:P<0.01;與牙周炎組相比,#:P<0.05

3 討 論

水凝膠因其易于操作、藥物分布均勻、良好的生物相容性而被廣泛用于局部藥物遞送系統(local drug delivery systems,LDDS),已有一些水凝膠制劑被開發出來并用于臨床牙周炎治療,比如含有米諾環素、甲硝唑等成分的水凝膠。然而細菌耐藥性及弱黏附力限制其運用。

理想的牙周局部給藥體系能對組織表面有一定黏附特性,這可以使之與牙周組織緊密接觸抵抗外力延長存留時間[15]。PEG-PLL中4-arm-PEG-SG上N-羥基琥珀酰亞胺活性酯與組織上的氨基發生原位的酰胺化反應從而使組織和凝膠黏合在一起[16]。通過使用濕潤的豬牙齦模擬體內情況并通過搭接剪切實驗檢測水凝膠的黏附能力,結果表明水凝膠有著良好的組織黏附性,這提示PEG-PLL水凝膠可能黏附在牙周袋內。此外,還檢測了水凝膠的力學性能,發現PEG-PLL水凝膠具有較高的斷裂壓縮強度和壓縮模量,能夠抵抗唾液的沖刷以及在咀嚼和吞咽過程中施加的壓力,從而延長在應用部位的保留時間[17],我們在其他的實驗中使用了臨床上常用于牙周炎治療的制劑派力奧作為對照,然而它對豬牙齦的黏附力約等于0 Pa,未能對組織產生明顯的黏附力。

對P.gingivalis的抗菌性實驗發現,PEG-PLL的抗菌性能有著濃度依賴性,這是因為水凝膠中的PLL濃度升高,會有更多的氨基暴露于水凝膠表面形成陽離子,陽離子密度越高,接觸殺菌的能力越強[18]。除此之外,醫用水凝膠最重要的是生物相容性,細胞毒性實驗表明,PLL濃度過高會產生一定的細胞毒性。最終水凝膠體系中PLL的濃度為20 mg/mL,此時水凝膠具有良好抗菌性能的同時,沒有明顯的細胞毒性。PLL是天然合成的抗菌肽,與蛋白質結構相似,另外采用酰胺化反應合成水凝膠避免了使用有細胞毒性的交聯劑,提高了水凝膠的細胞相容性[19]。

本研究使用Wistar大鼠結扎P.gingivalis絲線誘導建立大鼠牙周炎模型進一步探究PEG-PLL水凝膠對于牙周炎的治療效果,結果顯示,給予PEG-PLL水凝膠后具有較好的治療效果,相較于牙周炎組,明顯減輕了牙槽骨破壞。這可能與水凝膠在牙周袋內穩定存留,可持續殺滅牙周炎致病菌,維持了一個有利于牙周組織恢復的環境[20]。

綜上所述,本研究成功構建了一種具有固有抗菌黏附性可注射水凝膠,可有效減輕牙周破壞程度。此外該水凝膠具有微觀多孔結構,不僅利于營養物質的交換,還有利于藥物的釋放,在牙周炎治療方面具有良好應用前景。

特別鳴謝:感謝上海其勝生物制劑有限公司和姜芳老師對實驗的幫助與指導。