LAMC2 通過PI3K／Akt 信號通路調控胃癌細胞增殖的研究

王文博，汪清云，郭 衛，夏 泠*

（1.武漢大學中南醫院腹部腫瘤放化療科，武漢 430071；2.武漢大學泰康醫學院（基礎醫學院）病理教研室，武漢 430071）

胃癌（gastric cancer）是常見的惡性消化道腫瘤之一，是全球癌癥相關死亡的重要原因［1］。 雖然目前的診斷手段上有較大的改進，但大部分胃癌發病比較隱匿，確診時，患者已處于中晚期，這是導致胃癌患者生存率低、預后差的主要原因［2－3］，因此，篩選胃癌早期診斷標志物仍是胃癌的研究熱點［3－4］。層粘連蛋白γ2（laminin subunit gamma 2，LAMC2）是異三聚體糖蛋白層黏連蛋白332（laminin-332，Ln-332）的γ2 亞基，是上皮基底膜的基本成分，調節細胞粘附、運動，但越來越多的研究發現LACM2 與腫瘤的發生及進展關系密切［5］。 LAMC2 在胰腺導管癌、卵巢癌、喉癌及肺癌等多種腫瘤中均高表達，促進細胞增殖、上皮－間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），降低腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，已成為多種腫瘤的候選診治靶標［6－9］。 但目前，LAMC2 的表達是否影響胃癌細胞的增殖，目前報道較少。 本研究利用腫瘤基因圖譜（cancer genome atlas，TCGA）、基因表達綜合數據庫（gene expression omnibus，GEO）等數據庫，結合細胞生物學的檢測手段，觀察LAMC2 的表達對人胃癌細胞增殖的影響及可能調控機制。

1 材料和方法

1.1 細胞

人胃癌細胞（HGC-27、NCI-N87、SNU-1）均購自于國家模式與特色實驗細胞資源庫，由本實驗室保存；GES-1 人胃黏膜上皮細胞購自于賽百慷（上海）生物技術股份有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

RPMI 1640 細胞培養基（貨號：11875101）及優質胎牛血清（貨號：16000-044）購自于美國Gibco 公司； LipofectamineTM3000 轉 染 試 劑 盒（ 貨 號：L3000015）購自美國Thermo Fisher 公司；RIPA 裂解液（貨號：LS-W-03268）、PBS（貨號：LS-P-0106）、甲醇（貨號：LS-H-0248）、結晶紫染色液（貨號：LS-H-012）、4%多聚甲醛（貨號：LS-P-113）及Western blot試劑盒（貨號：LS-H-128）購自于武漢靈思生物技術有限公司；LAMC2（貨號：ab274376）、PCNA （貨號：ab29）、PI3 Kinase p85 α （phospho Y607）（貨號：ab182651）、 pan-AKT （ 貨 號： ab8805） 及 AKT（phospho T308）（貨號：ab38449）抗體購自于英國Abcam 公司；CyclinD1（貨號：26939-1-AP）、GAPDH（貨號：60004-1-Ig）、c-Myc（貨號：10828-1-AP）及辣根過氧化物酶（HRP） 標記的二抗（貨號：APC-65210）購自于武漢三鷹生物技術有限公司；細胞培養所需6 孔板、25 cm2培養瓶、96 孔板及15 mL 離心管購自美國Corning 公司。 陰性對照及LAMC2敲減siRNA 由廣州銳博生物科技有限公司設計及合成，序列參考課題組前期研究［9］。

BB150 型CO2細胞培養箱購自美國Thermo Fisher 公司；Lightcycler480 型熒光定量PCR 儀購自美國羅氏公司；DM3000 正置熒光顯微鏡購自德國萊卡；Varioskan LUX 酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；Mini Gel Tank 型垂直電泳槽購自美國Thermo Fisher 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 胃癌差異表達的基因篩選

基于| logFC |＞2 及P＜0.05 標準，edgeR R分析TCGA 及GEO 數據庫中GSE122530 數據，獲得胃 癌 差 異 表 達 基 因［9］。 通 過 CTD 數 據 庫（comparative toxicogenomics database，CTD，http：／ ／ctdbase.org／） 檢索與細胞增殖相關的基因。 將TCGA、GEO 所獲得的差異基因與CTD 數據庫所檢索得到的細胞增殖相關基因聯合分析，以TCGA 及GEO 中上調倍數最大的基因為候選基因。 利用UALCAN（http：／ ／ualcan.path.uab.edu／index.html）及Kaplan Meier plotter 數據庫（http：／ ／kmplot.com／analysis／）分析候選基因表達與胃癌臨床特征的關系。

1.3.2 細胞復蘇及培養

GES-1、HGC-27、NCI-N87 及SNU-1 細胞復蘇后，均利用含有10%胎牛血清及1%雙抗（青霉素100 U／mL，鏈霉素100 μg／mL）的RPMI 1640 培養基，置于37℃，5% CO2的細胞培養箱中培養，正常更換培養基，待細胞數量鋪滿培養瓶80%左右時，按照1 ∶2～3 的比例傳代。

1.3.3 Western blot 檢測LAMC2 在人胃癌細胞中的表達

參考課題組前期文獻方法［9］，收集GES-1 細胞及人胃癌細胞（HGC-27、NCI-N87、SNU-1），RIPA 裂解液（RIPA Lysis Buffer）裂解，提取總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒定量后，每組細胞按照20 mg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，電泳完成后轉印至PVDF膜上，以GAPDH（1 ∶10 000）為對照，LAMC2（1 ∶800）抗體4℃孵育過夜，TBST 漂洗3 次，每次5 min，加入HRP 標記的兔抗二抗（1 ∶1000），37℃孵育2 h，TBST 漂洗，加入ECL 發光液，凝膠成像系統拍照，ImageJ 2x 軟件分析各細胞中LAMC2 及GAPDH 的灰度值，以LAMC2 灰度值／GAPDH 灰度值的比值代表各細胞中LAMC2 的相對表達量。

1.3.4 LAMC2 敲減胃癌細胞模型構建

按照1×105／孔處于對數生長期的胃癌細胞（HGC-27、NCI-N87）接種于6 孔板中，待細胞鋪滿6孔板底部時，參照LipofectamineTM3000 轉染試劑盒的說明書，Control 組給予4 μL LipofectamineTM3000＋196 μL OptiRPMI 處理；轉染組處理如下：4 μL LipofectamineTM3000＋196 μL Opti-MEM 孵育5 min后，將其分別加入40 μL si-NC siRNA＋60 μL Opti-MEM 和40 μL si-LAMC2 siRNA＋60 μL Opti-MEM的混合液中，混合后靜置30 min，將混合液分別添加至對應的6 孔板中，6 h 更換成新的完全培養基。 轉染24 h 后，參考文獻［10］，Western blot 檢測LAMC2的表達，與Control 組、si-NC 組比較，LAMC2 表達差異有統計學意義，表示LAMC2 敲減胃癌細胞模型構建成功；同時，比較si-LAMC2-1＃及si-LAMC2-2＃的敲減效率，篩選敲減效果最明顯的siRNA 進行后續實驗。

1.3.5 EdU 檢測胃癌細胞增殖能力

按照1×105／孔處于對數生長期的胃癌細胞（HGC-27、NCI-N87）接種于6 孔板中，將胃癌細胞分成：Control 組、si-NC 組及si-LAMC2 組；各組細胞處理參照1.3.4，24 h 后，每孔細胞中加入總濃度為20 μmol／L 的EdU 工作液，置于細胞培養箱中繼續培養2 h 后，吸去培養基，37℃預熱PBS 漂洗3 次，每次3 ～5 min，4%多聚甲醛室溫固定20 min，熒光顯微鏡拍照，計算每組細胞中陽性細胞占總細胞數百分比。

1.3.6 平板克隆實驗檢測胃癌細胞克隆形成能力

取對數生長期的胃癌細胞（HGC-27、NCIN87），按照1×103／孔接種于6 孔板中，分組同1.3.5。 細胞培養2 周后，觀察到每組培養孔形成團狀細胞時，PBS 清洗3 次，5 min／次，4℃預冷甲醇固定細胞20 min，結晶紫染色1 h，超純水漂洗后晾干，倒置顯微鏡拍照，計數每組細胞中的總克隆數。

1.3.7 Western blot 檢測胃癌細胞增殖相關蛋白表達

取對數生長期的胃癌細胞（HGC-27、NCIN87），按照1×104／孔接種于6 孔板中，分組同1.3.5。 24 h 后，參考文獻［9］，以GAPDH（1：10 000）為對照，PCNA（1 ∶800）、CyclinD1（1 ∶800）及c-Myc（1 ∶1000）為一抗，Western blot 檢測，凝膠成像系統拍照，ImageJ2x 軟件分析各組細胞中各目的蛋白（PCNA、CyclinD1、c-Myc）及GAPDH 的灰度值，以各目的蛋白灰度值／GAPDH 灰度值的比值分別代表各目的蛋白相對表達量。

1.3.8 Western blot 檢測胃癌細胞PI3K／Akt 通路激活情況

取對數生長期的胃癌細胞（HGC-27、NCIN87），按照1×104／孔接種于6 孔板中，分組同1.3.5。 參考文獻［9］， PI3Kp85（1 ∶1000）、PI3Kp85（phospho Y607）（1 ∶500）、Akt（1 ∶1000）及AKT（phospho T308）（1 ∶800）為一抗，Western blot 檢測各 組 胃 癌 細 胞 中 PI3Kp85、 PI3Kp85 （ phospho Y607）、Akt 及AKT（phospho T308）的相對表達量，評價各組細胞PI3K／Akt 通路激活情況。

1.4 統計學方法

GraphPad Prism 6.0 進行數據統計及繪圖，所有實驗數據重復3 次，數據以平均數±標準差（±s）表示，多組間比較利用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。 以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LAMC2 在胃癌細胞中的表達

TCGA 及GSE122530 數據聯合分析發現，9 個基因與細胞增殖相關，其中LAMC2 上調倍數最大（圖1A），為此，LAMC2 為研究的候選基因。 胃腺癌是胃癌主要病理表現形式［1－3］，利用UALCAN 及Kaplan Meier plotter 數據庫分析發現，LAMC2 在胃腺癌中的表達顯著升高（P＜0.01），見圖1B。LAMC2 表達與胃腺癌的分期（P＜0.01）、分級（P＜0.01）及生存密切相關（P＜0.05），如圖1C ～1E。Western blot 檢測發現，胃癌細胞中（HGC-27、NCIN87、SNU-1）中LAMC2 的表達顯著高于GES-1 細胞（F＝93.780，P＝0.000），如圖1F、1G。 其中，HGC-27 細胞中LAMC2 表達量最低，NCI-N87 細胞中LAMC2 表達量最高，同時，參考文獻［11－12］及中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫及本實驗室胃癌細胞種源保藏情況，后續實驗選用HGC-27 及NCI-N87 細胞進行研究。

2.2 LAMC2 在si-LAMC2 組中胃癌細胞中的表達

Western blot 檢測發現，在HGC-27 細胞中，si-NC 組中LAMC2 的表達與Control 組無顯著變化（t＝0.379，P＝0.724）；si-LAMC2-1＃、si-LAMC2-2＃胃癌細胞中LAMC2 的表達均顯著低于si-NC 組（t＝6.774、16.290，P＝0.002、0.000）；與si-LAMC2-1＃比較，si-LAMC2-2＃中LAMC2 蛋白表達顯著降低（t＝13.610，P＝0.000），如圖2A 所示。 在NCI-N87 細胞中，得到類似的結果。 同時，在HGC-27 及NCIN87 細胞中，si-LAMC2-2＃具有更高的抑制效率，后續實驗采用si-LAMC2-2＃構建LAMC2 敲減胃癌細胞模型。 如圖2 所示。

2.3 LAMC2 對胃癌細胞增殖的影響

HGC-27 細胞中，si-NC 組細胞EdU 陽性率與Control 組無顯著差異（t＝1.549，P＝0.196）；si-LAMC2 組細胞EdU 陽性率較si-NC 組顯著減少（t＝6.540，P＝0.002）。 NCI-N87 細胞中，si-NC 組細胞EdU 陽性率與Control 組無顯著差異（t＝0.126，P＝0.906）；si-LAMC2 組細胞EdU 陽性率較si-NC 組顯著降低（t＝8.352，P＝0.001）。 以上暗示抑制LAMC2 后，可顯著抑制胃癌細胞增殖。 見圖3，表1。

表1 各組EdU 陽性細胞比例（±s）Table 1 Edu-positive cells rate in each group

表1 各組EdU 陽性細胞比例（±s）Table 1 Edu-positive cells rate in each group

注：HGC-27 細胞中，與陰性對照組比較， **P＜0.01；NCI-N87 細胞中，與陰性對照組比較， ＃＃P＜0.01。Note.In HGC-27 cells， compared with si-NC group， **P＜0.01.In NCIN87 cells， compared with si-NC group， ＃＃P＜0.01.

組別Groups HGC-27 EdU 陽性率（%）Edu positive cell rate NCI-N87 EdU 陽性率（%）Edu positive cell rate空白對照組Control group 71.12±6.55 66.34±6.56陰性對照組si-NC group 63.00±6.08 65.33±6.43 LAMC2 敲減組si-LAMC2 group 30.67±6.03** 25.67±5.13＃＃F 35.280 43.380 P 0.000 0.000

2.4 LAMC2 對胃癌細胞克隆形成能力的影響

通過細胞克隆數量檢測分析：HGC-27 細胞中，si-NC 組細胞克隆數與Control 組比較，無顯著變化（t＝0.519，P＝0.631）；與si-NC 組比較，si-LAMC2組較si-NC 組，細胞克隆數顯著減少（t＝11.420，P＜0.01）。 NCI-N87 細胞中，si-NC 組細胞克隆數與Control 組比較，無顯著變化（t＝0.484，P＝0.654）；si-LAMC2 組細胞克隆數較si-NC 組，顯著降低（t＝12.760，P＜0.01）。 見圖4，表2。

表2 各組細胞克隆數量（±s）Table 2 Number of cell clones in each group

表2 各組細胞克隆數量（±s）Table 2 Number of cell clones in each group

注：HGC-27 細胞中，與陰性對照組比較， **P＜0.01；NCI-N87 細胞中，與陰性對照組比較， ＃＃P＜0.01。Note.In HGC-27 cells， compared with si-NC group， **P＜0.01.In NCIN87 cells， compared with si-NC group， ＃＃P＜0.01.

組別Groups HGC-27克隆數（n）Number of cell clones NCI-N87克隆數（n）Number of cell clones空白對照組Control group 609.67±18.15 457.27±24.12陰性對照組si-NC group 594.16±29.37 439.00±35.34 LAMC2 敲減組si-LAMC2 group 148.54±18.03** 110.42±18.58＃＃670.500 156.200 P 0.000 0.000 F

圖4 克隆形成能力檢測胃癌細胞增殖Figure 4 Proliferation of gastric cancer cells detected by clone formation ability

2.5 LAMC2 對胃癌細胞增殖蛋白表達的影響

Western blot 檢測發現：HGC-27 細胞中，Control組PCNA、CyclinD1 及c-Myc 的表達分別為（0.58±0.05）、（0.68 ± 0.03）、 （0.66 ± 0.03）， si-NC 組CyclinD1、PCNA 及c-Myc 的表達分別為（0.59±0.02）、（0.67±0.03）、（0.65±0.03），si-LAMC2 組CyclinD1、PCNA 及c-Myc 的表達分別為（0.35±0.02）、（0.26±0.01）、（0.32±0.04），與si-NC 組比較，si-LAMC2 顯著抑制CyclinD1（t＝27.630，P＜0.01）、PCNA（t＝11.340，P＜0.01）及c-Myc（t＝11.340，P＜0.01）的表達。 NCI-N87 細胞中得到類似的結果。 見圖5。

注：HGC-27 細胞中，與陰性對照組比較， **P＜0.01；NCI-N87 細胞中，與陰性對照組比較， ＃＃P＜0.01。圖5 Western blot 檢測細胞增殖相關蛋白表達Note.In HGC-27 cells， compared with si-NC group， **P＜0.01.In NCI-N87 cells， compared with si-NC group， ＃＃P＜0.01.Figure 5 Expression of proliferation-related proteins detected by Western blot

2.6 LAMC2 對胃癌細胞PI3K／Akt 通路激活的影響

如圖6 所示，Western blot 檢測發現：HGC-27 細胞中，Control 組PI3Kp85（phospho Y607） 及Akt（phospho T308）的表達分別為（0.66±0.02）、（0.56±0.04）；si-NC 組PI3Kp85（phospho Y607）及Akt（phospho T308）的表達分別為（0.65±0.01）、（0.54±0.06）；si-LAMC2 組PI3Kp85（phospho Y607）及Akt（phospho T308）的表達分別為（0.24±0.03）、（0.18±0.04），與Control 組比較，si-NC 對PI3Kp85（phospho Y607） （t＝1.331，P＝0.254） 及Akt（phospho T308）（t＝0.308，P＝0.773）的表達無顯著影響。 與 si-NC 組 比 較， si-LAMC2 顯 著 抑 制PI3Kp85（phospho Y607）（t＝20.570，P＜0.01）及Akt（phospho T308）（t＝8.437，P＜0.01）的表達顯著降低。 NCI-N87 細胞中得到類似的結果。

注：HGC-27 細胞中，與陰性對照組比較， **P＜0.01；NCI-N87 細胞中，與陰性對照組比較， ＃＃P＜0.01。圖6 Western blot 檢測胃癌細胞中p-PI3K、p-Akt 表達Note.In HGC-27 cells， compared with si-NC group， **P＜0.01.In NCI-N87 cells， compared with si-NC group， ＃＃P＜0.01.Figure 6 Expression of p-PI3K and p-Akt in gastric cancer cells detected by Western blot

3 討論

胃癌是常見惡性消化道腫瘤之一，是引起全球范圍內癌癥相關死亡的主要惡性腫瘤，嚴重影響人類的身體健康和生活質量［1，13－14］。 我國是胃癌發病率較高的國家之一，約占全球病例的40%［12］。 手術切除和／或化療是胃癌目前臨床主要治療策略，但由于胃癌確診時已處于中晚期，導致胃癌患者5 年總生存率仍低于20%，并出現遠端轉移，預后較差［15－17］。 因此，深入探討胃癌發生及進展的分子機制，篩選胃癌早期診斷靶標，對胃癌患者的診治均具有重要意義。

LAMC2 是laminins 家族成員，作為Ln-332 的γ2 亞基，參與細胞增殖、侵襲、粘附及遷移等生物學的過程［18］。 但越來越多的研究發現，LACM2 單亞基與腫瘤的發生及進展關系密切［5］。 LAMC2 在喉癌中的表達顯著升高，其表達量與喉癌患者的TNM分期、淋巴結轉移、分化程度和總生存期相關，LAMC2 可顯著促進喉癌細胞增殖［19］。 在卵巢癌中，LAMC2 的表達較癌旁組顯著升高，抑制LAMC2的表達顯著降低卵巢癌細胞的增殖及侵襲；作為miR-5580-3p 的靶基因，LAMC2 的表達可被miR-5580-3p 顯著抑制［20］。 陰莖鱗狀細胞癌患者腫瘤組織及血清中LAMC2 的表達均顯著升高，LAMC2 可影響細胞的遷移、侵襲和EMT，進而促進腫瘤進展，LAMC2 可作為陰莖鱗狀細胞癌潛在的診治靶標［21］。 LAMC2 在口腔鱗狀細胞癌中的表達顯著升高，沉默LAMC2 可抑制口腔鱗狀細胞癌細胞增殖，促進細胞凋亡，上調N-cad、vimentin，下調E-cad 蛋白表達，抑制上皮間質轉化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT）過程［22］。 多組學聯合分析發現，LAMC2 在多種腫瘤的表達顯著上高，LAMC2 的表達不利于泛癌的臨床預后，并跟多種腫瘤免疫浸潤相關［23］。 課題組前期研究發現，抑制LAMC2 后，胃癌細胞的侵襲、遷移能力被顯著抑制［9］。 本研究首先通過TCGA、GEO 及介導細胞增殖相關基因聯合分析篩選影響胃癌增殖的相關差異表達的候選基因，結果發現LAMC2 在胃癌中的表達顯著升高，與胃癌患者的分級、分期及生存等臨床病理相關；體外實驗分析發現，LAMC2 的表達與胃癌細胞的增殖關系密切。

磷脂酰肌醇3－激酶（Phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）／蛋白激酶B（Portein kinase B，PKB）信號通路在胃癌、肝癌、肺癌等腫瘤中均被顯著激活，參與腫瘤的發生及進展［24］。 PI3K／Akt 通路激活與腫瘤細胞的發生、增殖、凋亡、侵襲及轉移、EMT、免疫微環境和耐藥密切相關，該通路抑制劑可顯著抑制腫瘤的進展［25－26］。 PI3K／Akt 通路可促進CyclinD1、p21、PCNA、c-Myc 等相關蛋白的表達，繼而促進細胞增殖［27－29］。 LAMC2 可通過激活PI3K／Akt 通路促進口腔鱗狀細胞癌中腫瘤干細胞的侵襲及遷移，進而導致腫瘤的增殖及復發［30］；LAMC2 可通過integrinβ1／FAK／Src 激活AKT 促進喉鱗狀細胞癌細胞增殖、侵襲和遷移［31］；LAMC2 可通過EGFR／ERK1／2 通路激活Akt，導致胰腺導管癌的進展［32］；LAMC2 可激活PI3K／Akt 通路促進卵巢癌細胞增殖，抑制其對吉西他濱的敏感性［33］。 以上研究說明LAMC2 可通過直接或者間接激活PI3K／Akt 通路，參與腫瘤的進展。 本研究檢測發現，抑制LAMC2的表達后，胃癌細胞中PI3K／Akt 通路被顯著抑制，降低PCNA、CyclinD1 及c-Myc 等細胞增殖等相關蛋白的表達，抑制胃癌細胞增殖，初步說明，LAMC2可通過激活PI3K／Akt 促進胃癌細胞增殖。

綜上所述，初步說明LAMC2 在胃癌中的表達顯著上調，與胃癌的分期、分級及生存等臨床組織病理相關，LAMC2 可通過激活PI3K／Akt 通路促進細胞增殖。 但本研究僅局限于細胞水平，后續還需利用動物及臨床水平深入研究LAMC2 與胃癌細胞增殖的關系及其影響PI3K／Akt 的具體作用機制。