清胰湯通過lncRNA-PVT1競爭性結合miR-146a靶向TRAF6參與重癥胰腺炎發生發展的機制研究

賴紀英 盧涵婧 郭宗文 岳霖琳 劉 欣 劉曉峰

（贛南醫學院第一附屬醫院重癥醫學科，江西 贛州 341000）

重癥胰腺炎又稱為出血壞死性胰腺炎，不僅能引起腹腔大出血、腸瘺，亦可引起多器官功能衰竭[1]。作為臨床上常見的急腹癥，死亡率能達到20.0%～40.0%，具有病情重、預后差等特點，為我國居民死亡的重要原因[2]。項紅等[3]研究表明急性重癥胰腺炎患者早期死亡高峰為1～2周左右，多數患者死于全身炎癥反應引起的多器官功能障礙綜合征。目前，急性重癥胰腺炎的確切分子機制尚未闡明，既往研究顯示腫瘤壞死因子受體相關因子6（TRAF6）能促進急性重癥胰腺炎所致的炎癥反應。因此，以此為靶點開發急性胰腺炎的治療藥物，具有很大的臨床價值。miR-146a是一種主要在免疫炎癥反應中起調控作用的微小核糖核酸（microRNA-146a，miR-146a）。Eliana Rodríguez等[4]研究表明miR-146a能夠下調靶基因TRAF6的表達，通過某些信號通路起到抑制炎癥反應作用，從而抑制急性重癥胰腺炎的病理過程。miR-146a能抑制靶基因TRAF6，且除了TRAF6外，尚存在一個未知的靶基因，對相關信號通路發揮抑制作用，miR-146a可能通過對TRF6與其他靶基因共同調節來調控相應的炎癥信號通路。漿細胞瘤多樣異位基因1（PVT1）是首個報道與腫瘤相關的長鏈非編碼RNA（Long non-coding RNA,lncRNA），lncRNA PVT1是一個原癌“基因”。史玉潔等[5]研究表明：清胰湯用于急性重癥胰腺炎患者中具有良好的效果，能下調lncRNA PVT1表達水平，促進miR-146a的表達，下調TRAF6的表達水平抑制炎癥反應，延緩病情進展，為患者后續治療奠定基礎。在哮喘相關炎癥中也證實了lncRNA PVT1通過靶向miR-423基因抑制炎癥反應[6]。因此，本研究主要探討清胰湯在重癥胰腺炎患者抑制炎癥反應的作用機制。

1 資料與方法

1.1 動物資料 購置SD大鼠50只，隨機取10只設為空白對照組；剩余40只大鼠采用4%牛黃膽酸鈉注射制備重癥胰腺炎動物模型，建模成功后隨機取10只為模型對照組；剩余30只大鼠分為清胰湯組、清胰湯+空載組（空白腺病毒轉染的空白載體組簡稱空載組）和清胰湯+PVT1沉默組，每組各10只。50只SD大鼠，雌雄隨機，體質量（200～220）g，平均（210.00±10.00）g。所選動物均購置于湖南農業大學動物實驗部。將購置的大鼠于動物房7 d適應性喂養，安靜環境飼養，室溫（22±2）℃，12 h交替光照，自由飲水，適應性喂養一周。

1.2 儀器與設備 生物機能實驗系統，型號：BL-420，購自于成都泰盟公司；電子分析天平，購自于德國賽多利斯公司；超低溫冰箱，購自于中國海爾公司；酶標儀，購自于美國BioTek公司；37℃恒溫箱，購自于上海實驗儀器廠；石蠟包埋機，購自于湖北孝感亞光醫用電子技術有限公司；光學顯微鏡，購自于日本Olympus公司；電泳裝置，型號：DYCP-31BM，購自于北京市六一儀器廠；凝膠成像及分析系統，型號：LabWorks TM，購自于美國UVP公司。

1.3 方法

1.3.1 建模方法 30只SD大鼠參與重癥胰腺炎模型建立，建模前均常規禁食24 h，禁飲4 h，給予濃度為10.0%水合氯醛（0.3 ml/100g）腹腔內注射麻醉。常規進行腹部剪毛，絡合碘消毒后，鋪無菌孔巾。待上述操作完畢后，在上腹正中線作長為3 cm的手術切口，并將切口下皮膚與肌層分離，打通切口到頸背部皮下隧道，逐層分離后進入腹腔。肉眼直視下確定十二指腸及胰腺部位，采用1號針頭在胰膽管兩側斜行穿刺進入十二指腸弓兩層腹膜之間潛在的間隙。給予濃度為5%牛磺酸膽堿，每100 g體質量0.1 ml，于3～5 min內注射完畢，輕輕按摩約15 s，保證藥物的均勻彌散，使得胰腺區彌漫性充血、膨脹。

1.3.2 慢病毒注射及處理方法

（1）慢病毒注射。攜帶shPVT1慢病毒（LVshPTV1，5×108TU/ml）及空載病毒（LV-Control，8×108TU/ml），購自于吉凱基因。于建模前2周，常規采用立體定位儀，采用微量加樣器將慢病毒注入SD大鼠右側結腸兩個位點：位點1：A-P1.0 mm，M-L-2.0 mm，D-V-1.2 mm；位點2：A-P-3.0 mm，M-L-1.5 mm，D-V-1.2 mm，每個位點注射2.5 μL?？刂坡《咀⑸渌俣葹?.5 μL/ml，拔針前原位停留5 min。

（2）大鼠處理方法。清胰湯組成：柴胡15 g、白芍15 g、黃芩10 g、木香10 g、黃連10 g，加水500 ml，瓦罐內文火熬制1h，濾渣，余液繼續文火熬煮濃縮到85 ml，置入生大黃15 g后，沖入芒硝10 g，常規制備生藥/溶液1∶1的成藥制劑，使用前將其放置在5℃冰箱中，保存。利用慢病毒轉染干擾lncRNA PVT1序列（LV-shPVT1）及空載（LV-control），分為清胰湯組、清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組，每日用藥1次，連續干預7 d[7-8]。

1.4 觀察指標

（1）HE染色。各組大鼠干預7 d后，斷頸方式處死，取胰腺組織，經石蠟包埋后制備4 μm切片，并完成HE染色[9]。

（2）炎癥因子。各組大鼠干預7 d后，以斷頸方式處死，取靜脈血5 ml，采用酶聯免疫吸附試驗測定腫瘤壞死因子-α（TNF-α）及白細胞介素-1β（IL-1β）水平；采用實時熒光PCR法測定各組miR-146a水平。

（3）TRAF6及細胞凋亡相關基因表達。采用Western blot法測定各組TRAF6及細胞凋亡相關基因（包括β-actin、ki-67、Bax、caspase、Caspase-9）表達，采用BiO-R重癥胰腺炎圖像分析系統照相，并利用Quantity One v4.6.2軟件分析[10]。

1.5 統計分析 采用SPSS 26.0軟件處理，計數資料行χ2檢驗，采用n（%）表示；多組計量數據比較采用F檢驗，兩組間計量資料行t檢驗，采用±s表示，P＜0.05差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組胰腺組織HE染色結果比較 HE染色結果表明，清胰湯組病理學改善顯著，胰腺組織內炎癥細胞浸潤明顯減輕；清胰湯+空載組和模型組胰腺組織內可見微血栓形成，且隨著時間延長加重，炎癥細胞浸潤明顯，伴有上皮細胞炎性浸潤；而清胰湯+PVT1沉默組則介于清胰湯組和清胰湯+空載組之間，見圖1。

圖1 各組小鼠胰腺組織HE染色

2.2 各組炎癥因子及miR-146a表達水平比較 清胰湯組TNF-α、IL-1β表達水平均低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）；miR-146a表達水平高于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）。清胰湯+空載組TNF-α、IL-1β水平高于和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05），miR-146a水平低于清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）。見表1。

2.3 各組TRAF6及細胞凋亡相關基因表達比較 清胰湯組TRAF6表達水平低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）；細胞凋亡相關基因β-actin、ki-67、Bax、caspase-3、Caspase-9表達水平低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）；清胰湯+PVT1沉默組以上指標表達水平低于清胰湯+空載組（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組TRAF6及細胞凋亡相關基因表達比較

3 討論

重癥急性胰腺炎起病急驟、病情兇險、合并癥多、死亡率較高，且臨床治療復雜、住院時間長，醫療費用較高，增加家庭及社會負擔[11]。Wang C等[12]研究表明：重癥急性胰腺炎患者常伴有胃腸動力障礙，增加麻痹性腸梗阻、腹腔間隔室綜合征及腸道菌群移位等并發癥發生率。但是，臨床上對于重癥急性胰腺炎患者的分子機制尚未闡明。TRAF6能顯著促進急性重癥胰腺炎所致的炎癥反應，以此為靶點開發急性重癥胰腺炎的治療藥物據有很大的臨床價值。本研究中，HE染色結果表明，清胰湯組病理學改善顯著，胰腺組織內炎性細胞浸潤減輕明顯；清胰湯+空載組和模型組可見微血栓形成，且隨著時間延長加重，炎性細胞浸潤明顯，伴有上皮細胞炎性浸潤。本研究中，重癥胰腺炎大鼠建模成功后，伴有病理學的改變，表現為炎性細胞的大量浸潤。而清胰湯的使用，能改善重癥急性胰腺炎大鼠癥狀，能降低機體內的炎癥反應。分析原因清胰湯屬于中醫常用湯藥，主要由柴胡、白芍、黃芩、木香、黃連等藥物組成。方藥中，柴胡具有解表退熱、疏肝解郁功效；白芍能發揮斂陰止汗、柔肝止痛功效；黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒功效；木香能發揮疏理肝氣、行氣止痛作用；黃連具有清熱燥濕、瀉火解毒功效；諸藥共奏，能促進胃腸蠕動，降低腸腔內壓力，保護腸黏膜屏障，抑制菌群移位[13]。本研究中，清胰湯組TNF-α、IL-1β水平均低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05），而miR-146a水平高于其他組，這提示清胰湯能降低重癥急性胰腺炎大鼠炎癥反應。

本研究通過生物信息學軟件Starbase V2.0篩選出與TRAF6存在結合位點的miR-146a，二者呈現明顯負相關，在急性重癥胰腺炎患者可通過提高miR-146a的表達，的靶向下調TRAF6，抑制炎癥反應，抑制急性重癥胰腺炎的病理進程。同時，通過生物信息軟件Starbase V2.0分析篩選出能夠在急性胰腺炎組織中高表達，且與miR-146a啟動子3'-UTR區域存在明顯結合位點的lncRNA PVT1。而清胰湯的使用能下調lncRNA PVT1的表達，上調miR-146a的表達水平，通過對TRAF6的抑制等多個通路抑制炎癥反應，減緩急性重癥胰腺炎的發生發展[14]。本研究中，清胰湯組TRAF6表達水平低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05）；細胞凋亡相關基因β-actin、ki-67、Bax、caspase、Caspase-9表達水平低于清胰湯+空載組和清胰湯+PVT1沉默組（P＜0.05），這提示清胰湯的使用能下調lncRNA PVT1表達，抑制細胞凋亡，延緩病情發展。明確相關的作用機制可為重癥急性胰腺炎的治療提供新的思路。

綜上所述，在重癥胰腺炎中，清胰湯能通顯著下調lncRNA-PVT1表達，上調miR-146a的表達水平，通過靶向抑制TRAF6等相關通路，抑制炎癥反應，抑制細胞凋亡，減緩重癥胰腺炎的病理進展，改善患者預后。