SREBP2及PI3K/Akt/mTORC2在喉癌中的表達及相關性研究*

陳 薇,楊 勇

(江西省人民醫院/南昌醫學院第一附屬醫院甲狀腺頭頸外科,江西 南昌 330006)

喉癌是一種來源于喉部黏膜上皮的惡性腫瘤,其中96%～98%為鱗狀細胞癌,2020年全球喉部鱗癌發病率占頭頸部鱗癌的21%,位居第二,男性發病率高于女性,男性喉癌發病率為3.6/10萬,死亡率為1.9/10萬,女性喉癌發病率為0.5/10萬,死亡率為0.3/10萬[1]。喉癌臨床表現多見為聲音嘶啞、咽喉異物感、咳嗽、吞咽困難、頸部質硬包塊、呼吸困難等,其發生主要與吸煙喝酒、病毒感染、環境及遺傳因素相關[2]。目前喉癌治療方案為以手術治療為主,以放療、化療及免疫治療為輔的綜合治療[3]。早期喉癌癥狀不明顯,明確診斷時多為中晚期,盡管喉癌的治療方式日趨完善,但晚期喉癌患者在治療后多因局部復發和遠處轉移而導致預后較差。進一步研究喉癌的病因和分子機制,尋找和開發有效的治療靶點,將會對喉癌的早期診斷、治療及改善預后產生重要作用。近年來,針對腫瘤細胞的異常代謝過程,靶向代謝重編程已成為潛在的腫瘤治療方案之一。膽固醇調節元件結合蛋白2(SREBP2)是近年來在多種研究中異常表達的調控脂質代謝的關鍵轉錄因子,基礎研究發現靶向SREBP2具有一定的抗腫瘤效果,可作為靶向代謝重編程的靶點[4]。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白C2(mTORC2)信號通路參與了眾多癌癥細胞自噬、凋亡、組織轉移過程,其異常激活會影響多種腫瘤細胞增殖和轉移的演進過程[5]。PI3K/AKT/mTORC2信號通路是調控SREBP2表達的關鍵通路,在卵巢癌中可促進膽固醇的合成及腫瘤生長[6]。然而PI3K/AKT/mTORC2信號通路及SREBP2分子在喉癌中的表達及作用機制尚不清楚。本研究聚焦PI3K/AKT/mTORC2及SREBP2在喉癌組織中的表達水平,為開發以SREBP2為靶點的喉癌靶向代謝重編程療法提供依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取本院2019年1月至2022年6月病理確診為原發性喉癌的患者60例,其中男55例,女5例,年齡47～87歲,平均(67.93±8.83)歲。所有研究病例均已知曉本次研究內容及目的,且自愿簽署知情同意書。本研究已獲得醫院醫學倫理委員會批準。排除標準:(1)曾接受放療、化療及免疫治療者;(2)合并其他器官、造血系統嚴重疾病者;(3)合并精神或神經性疾病患者。

1.2方法

1.2.1樣本采集 收集患者的腫瘤組織(喉鱗狀細胞腫瘤組織)及癌旁組織(聲帶息肉)樣本,使用多聚甲醛固定10～12 h后脫水、石蠟包埋、組織切片,用于免疫組織化學(免疫組化)檢測。

1.2.2主要試劑 兔抗人SREBP2單克隆抗體購自江蘇親科生物研究中心有限公司,兔抗人PI3K單克隆抗體購自福建邁新生物技術公司,鼠抗人AKT單克隆抗體、二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑均購自北京中杉金橋生物技術有限公司,鼠抗人mTORC2單克隆抗體購自北京百奧萊博科技有限公司。

1.2.3免疫組化(Envsion二步法) 將組織置于67 ℃烤箱中烘烤30 min,二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化。使用高壓熱修復行抗原修復,冷卻后蒸餾水沖洗 2次,后用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次,每次3 min。以含1% 牛血清白蛋白(BSA)的磷酸鹽平衡生理鹽水緩沖液(PBS)進行封閉處理,作用30 min。3%過氧化氫去離子水室溫下孵育10 min,PBS沖洗3次,每次3 min。滴加一抗(預試驗選定PI3K抗體為即用型,AKT抗體的工作濃度為1∶200,mTORC2抗體的工作濃度為1∶200,SREBP2抗體的工作濃度為1∶200),室溫下孵育2 h。PBS沖洗3次,每次5 min。滴加新鮮配制的DAB顯色,顯微鏡下觀察以適度為止。蘇木精復染,自來水沖洗,梯度乙醇脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封固。上述步驟中由試劑公司提供照片作為陽性對照,用 PBS代替一抗作為陰性對照,以排除非特異性著色。

1.2.4免疫組化結果判定標準 按切片中細胞染色強度評分:無色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分;每張切片在400×顯微鏡下任意選取5格不重疊視野進行陽性細胞計數,每個視野計數200個細胞,計算5個視野中的陽性細胞色平均百分比,按照百分比計分:0為0分,>0～25%為1分,>25%～50%為2分,>50%～75%為3分,>75%～100%為4分。以上兩項得分相加(0～7分),<3分為(-),3分為(+),>3～5分為(++),>5～7分為(+++)。分別計數各項得分的例數。

2 結 果

2.1不同倍數顯微鏡觀察下各分子在喉癌組織中表達情況 在高倍顯微鏡(400×)觀察下,相較于癌旁組織,PI3K、AKT、mTORC2在喉癌組織中高表達,并主要定位于細胞核和細胞質中;SREBP2在喉癌組織中高表達,并主要定位于細胞核中,見圖1。PI3K、AKT、mTORC2與SREBP2在低倍顯微鏡(200×)觀察下表達情況見圖2。

2.2各分子在不同組織中陽性表達情況 各分子在腫瘤組織中表達陽性率顯著高于癌旁組織,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3不同臨床特征患者各分子陽性表達情況比較 不同性別、年齡、吸煙(包/年)、腫瘤部位患者PI3K、AKT、mTORC2、SERBP2表達情況比較,差異均無統計學意義(P>0.05);腫瘤直徑大于或等于3 cm患者AKT、mTORC2、SERBP2陽性表達率均高于腫瘤直徑小于3 cm患者,差異均有統計學意義(P<0.05);臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者AKT、SERBP2陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期患者,差異均有統計學意義(P<0.05);不同分化程度患者PI3K、AKT陽性表達率比較,差異均無統計學意義(P>0.05),不同分化程度患者mTORC2、SERBP2陽性表達率比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床特征患者各分子陽性表達情況比較[n(%)]

2.4各分子不同表達患者預后情況比較 PI3K、AKT、mTORC2、SERBP2陽性表達患者2年生存率均低于陰性表達患者,但是兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各分子不同表達患者預后情況比較

3 討 論

喉癌是耳鼻咽喉頭頸外科常見的惡性腫瘤。有研究認為,吸煙是喉癌發生的首要致病因素,長期大量的吸煙、喝酒會干擾細胞抑癌基因的代謝,促進細胞的異常增殖,導致喉癌的發生[7]。目前,與喉癌相關的分子機制主要有:(1)信號調控異常,如NER、BER、DSBR通路及MMR信號通路傳導異常;(2)基因突變,如MYCT、POM121突變及編碼多種microRNA的基因突變;(3)抑癌基因的異常甲基化;(4)線粒體基因改變;(5)線粒體呼吸功能障礙等。

喉癌細胞生長、增殖、侵襲和轉移與能量代謝和遺傳相關。腫瘤細胞的生長、增殖、侵襲和轉移需要大量能量,故腫瘤細胞的演進過程常與脂質代謝異常相伴而行[8]。SREBP是脂類代謝合成和致癌信號通路中關鍵的轉錄因子[9],有3種亞型:SREBP1a、SREBP1c和SREBP2,其中SREBP2在各臟器中均廣泛表達,主要調控膽固醇合成代謝[10],轉運至高爾基體產生SREBP2m,可進入細胞核后,調控MVA通路,參與脂質代謝及膽固醇合成[11]。多種細胞信號通路對SREBP2成熟具有調控作用,胰島素可以通過PI3K/AKT/mTORC2信號通路激活SREBP2的表達,加速膽固醇從頭合成。SREBP2與炎癥、自噬和細胞凋亡的致病過程密切相關,加速多種代謝紊亂的發生、發展[12]。SREBP2在多種癌細胞中被激活,其下游參與脂代謝的靶基因表達升高,參與腫瘤細胞的發生、發展[4]。JIE等[13]研究發現,SREBP2通過促進破骨細胞生成和乳腺癌轉移來加重乳腺癌相關的骨質溶解。GAO等[14]通過使用SREBP活化的特異性抑制劑fatostatin,證實阻斷子宮內膜癌中SREBP調節的代謝途徑可抑制腫瘤生長并增強細胞凋亡。李曉楓等[15]研究顯示SREBP2在原發性肝癌中高表達,與病理類型、分化程度、門靜脈侵襲及TNM分期等臨床特征及預后有關,SREBP2高表達明顯增加患者死亡風險。劉坤等[16]研究在腎癌細胞中,SREBP等許多脂質代謝的關鍵因子發生改變,通過脂類抑制劑能抑制腎癌細胞的生長;膽固醇代謝基因SREBP1和SREBP2的表達,可通過增加VEGF-C的表達誘導淋巴管生成,促進胃癌淋巴結轉移。張莉等[17]證實了SREBP2通過改變結腸癌的細胞代謝來抑制結腸癌的生長,同時降低了與癌癥干細胞相關基因的表達。YU等[18]研究發現lincRNA,SNHG16通過直接miR-195/SREBP 2軸調控脂肪生成,促進胰腺癌的發展。目前,在肝癌、結腸癌、胃癌、乳腺癌、子宮內膜癌、腎癌、前列腺癌、胰腺癌等腫瘤中均已發現異常表達的SREBP2[13-16]。

近年來,針對腫瘤細胞的異常代謝過程,靶向代謝重編程已成為潛在的腫瘤治療方案之一。PI3K/AKT/mTORC2信號通路是調節SREBP1和SREBP2表達的關鍵信號通路,通過mTORC2分子調控卵巢癌細胞中SREBP2表達,并影響膽固醇代謝及腫瘤生長[6]。目前,許多靶向PI3K信號通路抑制劑已進入臨床試驗,如BKM120(布帕利西布)是一種口服泛Ⅰ類可逆PI3K抑制劑,在耐受劑量下在人腫瘤異種移植模型中表現出良好的口服生物利用度和顯著的抗腫瘤活性[17]。靶向SREBP2同樣具有潛在的抗腫瘤作用。WEI等[19]證實可溶的青蒿素類似物青蒿琥酯可通過抑制SREBP2的核定位及其靶基因HMGCR的表達,限制MVA途徑來加速膠質瘤細胞衰老,具有潛在的抗腫瘤作用。KIM等[20]證實大黃素聯合索拉非尼可抑制肝癌細胞中SREBP2轉錄活性,從而抑制膽固醇生物合成和致癌AKT信號傳導,是晚期肝癌患者潛在的療法之一。有研究證實,SREBP1和SREBP2是PI3K信號通路調控的下游分子之一[21],而靶向SREBP2的基礎研究也顯示了較好的腫瘤抑制效果[22],表明靶向PI3K治療腫瘤的可能機制之一是抑制SREBP2表達。本研究發現喉鱗狀細胞癌患者腫瘤組織中PI3K/AKT/mTORC2通路分子及SREBP2高表達,而間質組織細胞陰性,相較于癌旁組織,喉癌組織PI3K、AKT、mTORC2及SREBP2分子表達陽性率顯著升高,蛋白質水平證實了PI3K/AKT/mTORC2信號通路及SREBP2分子在喉癌組織中的異常表達,是潛在的喉癌靶向代謝重編程治療的靶點。

本文選取原發性喉癌患者60例,取腫瘤組織及癌旁組織樣本,以免疫組化法測定PI3K、AKT、mTORC2及SREBP2表達情況并進行比較。腫瘤組織PI3K(88.3%vs.40.0%)、AKT(76.7%vs.31.7%)、mTORC2(78.3%vs.21.7%)、SERBP2(65.0%vs.8.3%)陽性表達率高于癌旁組織,差異均有統計學意義(P<0.05)。腫瘤直徑大于或等于3 cm患者AKT、mTORC2、SERBP2陽性表達率高于腫瘤直徑小于3 cm患者,差異均有統計學意義(P<0.05);臨床分期Ⅲ～Ⅳ期患者AKT、SERBP2陽性表達率高于Ⅰ～Ⅱ期患者,差異均有統計學意義(P<0.05);不同分化程度患者mTORC2、SERBP2陽性表達率比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。PI3K、AKT、mTORC2、SERBP2陽性表達患者2年生存率低于陰性表達患者,但差異無統計學意義(P>0.05)。

綜上所述,喉癌患者腫瘤組織中PI3K/AKT/mTORC2信號通路分子及SREBP2分子蛋白質水平存在異常表達,相較于聲帶息肉,喉癌組織PI3K、AKT、mTORC2及SREBP2分子表達陽性率顯著升高,是潛在的喉癌靶向代謝重編程治療的靶點。