蝴蝶蘭無菌播種組培快繁技術研究

鄭秋樺，黎棟然，潘燁鑫，漆 萍，巫躍君

（1.韶關學院英東生物與農業學院，廣東 韶關 512005；2.廣東藝景生態環境建設有限公司，廣東 韶關 512031）

蝴蝶蘭為蘭科蝴蝶蘭屬，為附生性蘭花，素有“洋蘭王后”之稱。新春時節，蝴蝶蘭植株從葉腋中抽出花梗，開出形如蝴蝶的花朵，獨特而優美的姿態深受消費者青睞。蝴蝶蘭原產于亞熱帶雨林地區，分布在印度尼西亞、菲律賓、泰國、馬來西亞及中國臺灣等地。通過人工調控各種因素使蝴蝶蘭于春節前開放，極大地滿足了國內年宵花的市場需求。隨著近年來種植面積和產銷量增加，我國蝴蝶蘭產業得到跨越式發展，已逐漸成為全球蝴蝶蘭種苗供應中心［1］。蝴蝶蘭的種子非常細小，不含有為種子萌發提供營養的胚乳或其他組織，胚發育不完全，在自然條件下很難萌發［2］，因此蘭科種子的無菌培養是工廠化生產蘭花種苗的一條重要途徑。

文章在原有培養基的基礎上，通過調整6-BA濃度，設置6-BA 濃度梯度，分別培養新雜交品種蝴蝶蘭種子（納博納交櫻桃番茄、納博納交矩寶橘子），研究不同6-BA 濃度下培養基對于誘導蝴蝶蘭種子原球莖形成的作用效果。通過設置不同6-BA濃度、NAA 濃度及不同添加物組合，探究其對誘導原球莖芽分化的影響，優化培養基，提高培養基的應用價值。

1 試驗材料和方法

1.1 材料和試劑

材料：納博納交矩寶橘子果莢（取自蝴蝶蘭基地）、納博納交櫻桃番茄果莢（取自蝴蝶蘭基地）、椰子水、土豆、香蕉、蔗糖。

主要試劑：MS 培養基、1 mg/L 6-BA、1 mg/L KT、1 mg/L NAA、瓊脂粉、1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH、蒸餾水、75%的酒精、0.1% HgCl2、無菌水、消毒液（工作臺）。

1.2 儀器和設備

電子秤、稱量紙、玻璃棒、大燒杯、小燒杯、2 mL移液管、洗耳球、電磁爐、鐵鍋、膠頭滴管、容量瓶、鉛筆、標簽紙、量筒、培養瓶、高壓蒸汽滅菌鍋、pH 試紙、紙巾、超凈工作臺、高溫消毒器、接種器械（解剖刀、剪刀、鑷子等）、無菌不銹鋼碟子、酒精燈、記號筆等。

1.3 試驗方法

1.3.1 預試驗

配制1 mol/L HCl、1 mol/L NaOH。稱取MS 培養基粉溶解于蒸餾水后倒入大燒杯，分別量取適量的6-BA、KT、NAA 加入其中。在鍋中加入蒸餾水，蒸餾水潤洗燒杯3 次，中火煮至溶解，慢慢加入瓊脂粉，小火煮開后將蔗糖-瓊脂粉溶液倒入燒杯與其他混合溶液攪拌均勻，調節pH 值。將混合溶液轉移至1 L 容量瓶定容，用量筒量取培養基分裝到培養瓶中，在標簽紙上寫明配制日期、配制人、培養基類型并貼在培養瓶上。準備好瓶裝蒸餾水、75%酒精、HgCl2和空培養瓶，除了酒精以外，所有培養瓶經過高壓蒸汽滅菌后冷卻待用。

1.3.2 無菌播種

開裂的果莢內部往往存在微生物，因此需檢查果莢完整度。若果莢完好無損，則可以作為試驗材料；若果莢已經開裂或存在破損，則需要更換材料。用自來水沖洗果莢，摘除花瓣和花萼后用洗潔精洗滌，去除表面污漬和灰塵，接著用75%酒精擦拭，放在解剖盤中轉移到超凈工作臺上，用解剖刀切除兩端多余部分后（方便操作，但不能露出內部的種子）用鑷子轉到無菌瓶中。將75%酒精倒入放置果莢的無菌瓶中浸泡30 s，將果莢轉移到裝無菌水的瓶子中沖洗2 次［3］。用0.1%升汞浸泡果莢10～12 min，中途需搖晃瓶身，保證果莢被充分浸泡，用無菌水沖洗8 次后取出蒴果，置于托盤中［4］。取無菌紙將果莢表面的水分吸干，防止種子被粘住而影響播種。用解剖刀縱切，采用撒播法，用鑷子挑出大小一致的棉絮狀物體，將種子均勻撒播在培養基上，蓋好瓶蓋并貼上標簽。每個濃度的培養瓶重復3 次，將培養基置于溫度26 ℃、光照強度1 500 lx、光照時長12 h/d 的環境中培養。

1.3.3 原球莖芽分化誘導

在一定閾值內，低濃度6-BA 和高濃度的NAA有利于誘導原球莖產生叢生芽［5］，因此就6-BA 和NAA 濃度設置了12 個對照組，如表1所示。

表1 原球莖芽誘導劑中不同6-BA和NAA濃度正交試驗對照組

不同添加物對于原球莖的叢生芽誘導影響可能存在差異，設置4 個對照組可以降低成本，提高芽誘導效率，如表2所示。

表2 原球莖芽誘導劑中不同添加物對照組

在試驗前分別配制各組培養基，高壓滅菌后放置冷卻備用。在無菌操作下用鑷子將母瓶中的原球莖轉移到無菌解剖盤中，由于每個無菌播種培養瓶中原球莖數量較多，完成一次母瓶的接種時間較長，且超凈工作室風速較大，一次取出過多原球莖會導致部分原球莖失水粘住解剖盤，失去利用價值，因此接種時每次應取出適量原球莖，一個母瓶中的原球莖分多次取出接種。分別將原球莖接種到各培養瓶中，每組接5 瓶，每瓶30 個原球莖，重復12 次。接種時應將原球莖的突起一端朝下，凹陷或非突起的一端朝上，否則會導致原球莖長勢不佳，容易產生較多醌類物質，導致原球莖壞死。將完成接種的培養瓶放置在溫度為26 ℃、光照強度1 500 lx、光照時長12 h/d 的環境中培養，觀察原球莖的生長狀態以及是否發生污染。

2 結果與分析

2.1 無菌播種原球莖誘導試驗結果與分析

在一定范圍內，隨著培養基中6-BA 濃度的提高，納博納交矩寶橘子蝴蝶蘭雜交種子萌發率也會有所提高。其中種子萌發的最適6-BA 濃度為≥4.5 mg/L。不同6-BA 濃度的培養基中原球莖中產生的醌類物質明顯不同，除了4.0、4.5 mg/L 濃度6-BA 培養基外，其他濃度6-BA 培養基中原球莖都產生了較多醌類物質。其中，添加1.5、2.0 mg/L 濃度的6-BA 培養基中的原球莖產生的醌類物質最多，這些培養基中產生的醌類物質能夠隨著時間的推移擴散，短期內不會對原球莖產生毒害。

該試驗中，播種后4 d 內種子膨大，50 d 后納博納交櫻桃番茄蝴蝶蘭雜交種子的萌發率依舊為0，經過一段時間暗處理后出現零星的原球莖。推測可能是由于種子發育不良導致原球莖產生速度緩慢，或是該雜交品種蝴蝶蘭種子的萌發需要進行暗處理。

2.2 原球莖芽分化誘導劑正交試驗結果與分析

在一定濃度范圍內，濃度較低的NAA 有利于納博納交矩寶橘子蝴蝶蘭雜交新品種原球莖的芽分化，其中最適NAA 濃度值為3.0 mg/L。本試驗中設置不同6-BA 濃度的培養基中原球莖芽分化的情況大致表現為6-BA 濃度越高原球莖芽分化率越高，即促進原球莖芽分化的最適6-BA 濃度≥0.5 mg/L。

在不同6-BA 和NAA 濃度組合的培養基中，原球莖中產生的醌類物質的量存在差別。根據培養基的顏色來看，本試驗設置的組合中較低濃度的NAA 和6-BA 組合容易使原球莖產生有毒的醌類物質。不同濃度6-BA 中原球莖產生的醌類物質并無太大區別，結合第1 階段培養現象，推斷第2 階段中出現的現象是由于該培養階段培養基中6-BA 濃度梯度設置較小。不同濃度NAA 中原球莖產生的醌類物質的區分較為明顯，低濃度的NAA 易使原球莖產生更多的醌類物質，這些醌類物質難以在培養基中擴散開，對原球莖具有毒害作用，少數原球莖經過30 d 培養后褐化死亡。由此得出，在誘導該新雜交品種蝴蝶蘭原球莖芽分化時需關注醌類物質的產生情況，及時轉移原球莖。

2.3 原球莖芽誘導劑中加入不同添加物試驗結果與分析

根據表2 的試驗條件依次進行正交試驗，記錄數據并進行分析，試驗結果如表3所示。

表3 原球莖芽誘導劑中加入不同添加物試驗結果

由表3 可以得出，與空白對照組相比，添加了土豆、香蕉汁或椰子水的培養基會對原球莖芽形成產生促進作用。其中，椰子水與土豆、香蕉汁相比促進效果更為明顯。在這組試驗中，香蕉汁、土豆和空白對照組中培養基未見顯色物質，推測未產生或僅產生少量醌類物質。

3 結論

本試驗通過配置含不同激素水平及添加物的培養基對納博納交櫻桃番茄和納博納交矩寶橘子2 種新雜交品種蝴蝶蘭種子和原球莖進行階段性培養，探究不同6-BA 濃度對于誘導新雜交品種蝴蝶蘭種子形成原球莖的影響，6-BA、NAA 濃度以及香蕉汁、椰子水與土豆對于原球莖芽分化的影響。

在植物生長調節劑添加方面，納博納交櫻桃番茄蝴蝶蘭雜交種子最終長出了零星的原球莖，推測可能是由于種子發育不良導致原球莖產生速度緩慢，或是該雜交品種蝴蝶蘭種子的萌發需要進行暗處理。第1 階段實驗結果顯示最適NAA 濃度值約為3.0 mg/L，符合前人的研究。第2 階段試驗結果可以得出，納博納交矩寶橘子原球莖芽誘導最適NAA 濃度為3.0 mg/L，最適6-BA 濃度為0.25 mg/L，當6-BA 濃度高于或低于該值時，原球莖的芽分化率會下降。在添加物方面，添加了土豆、香蕉汁或椰子水的培養基對原球莖芽誘導產生促進作用。在添加物方面，椰子水與土豆、香蕉汁相比促進效果更為明顯。

此外，本試驗中還發現了一些現象。在種子萌發形成原球莖階段，低濃度6-BA 的環境會使原球莖產生較多的醌類物質，但短期內不會對其成活造成影響，后期保留觀察的無菌播種培養瓶中原球莖長勢良好，大部分分化出芽，但與芽誘導培養基中原球莖分化出的芽相比，無菌播種培養基中的芽個體明顯較小。同時，培養基褐色變淡，推測可能是這一階段醌類物質含量會隨著培養時間的推移減少。在誘導原球莖芽分化階段，由于芽分化比較緩慢，在接種后30 d 進行數據統計，統計出的數據規律性不強，難以體現出不同組合培養基對于蝴蝶蘭原球莖芽誘導影響的差別；在接種后45 d 進行數據統計，得到同一組內數據的可信度較高，不同組數據呈現出一定的規律，由此推斷蝴蝶蘭原球莖芽誘導劑最佳數據收集時間應≥45 d。由于6-BA 濃度梯度設置較窄，整體看來在這一階段低濃度的6-BA不會使原球莖產生大量醌類物質；低濃度的NAA 會使原球莖產生醌類物質的量明顯增加，能夠在短期內對原球莖產生毒害作用，若要保證芽分化的效率需關注醌類物質的產生情況并及時轉移原球莖。在不同添加物對照試驗中，香蕉汁、土豆和空白對照組中沒有或僅有極少量醌類物質產生。