結核分枝桿菌復合群檢驗中應用熒光定量PCR方法的臨床價值

王強

長春市傳染病醫院檢驗科，吉林長春 130000

結核病是危害公共衛生健康安全的疾病，及早診斷對于疾病傳播的預防具有積極作用，臨床診斷結核病的方式，主要以實驗室培養為主，該種檢查方式需較長時間才能得出結果，具有檢驗效率低、不能夠實施大數據篩查、診斷效果欠佳的特點[1]。隨著各種結核分枝桿菌復合群檢測方法的不斷涌現，包括涂片法、固體培養法、恒溫擴增法等，選擇適合不同實驗室條件、準確度高、性價比高的一種檢測方式十分必要，實驗室進行診斷技術選擇時，需要綜合考慮實驗室條件、時效性、試劑成本、操作依從性等，選擇最適合的結核病診斷技術[2]。熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）法可以對結核分枝桿菌復合群實際狀態進行有效鑒別，具有較高的靈敏度和特異度，對于臨床診斷和治療，具有更科學的指導意義[3]。基于此，本文選取2022年3月—2023年5月在長春市傳染病醫院治療的118例疑似結核患者進行研究，探討熒光定PCR方法對結核分枝桿菌復合群的檢驗效果，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在本院診治的118例疑似結核患者作為研究對象，男60例，女58例；年齡20～68歲，平均（41.17±7.26）歲。共計156份臨床樣本。本研究的開展已經獲取醫學倫理相關組織的審批，患者已了解本研究實施過程和目的，簽訂了同意協議。

1.2 納入與排除標準

納入標準：①年齡≥18歲患者；②資料沒有缺失情況患者；③配合良好，能夠完成本研究患者；④無精神疾病史患者；⑤無智力障礙，可正常溝通患者。

排除標準：①未留取標本患者；②痰標本劑量不足2 mL患者；③標本屬于唾液痰患者；④近1個月內進行抗結核治療超過2周患者；⑤中途退出研究患者。

1.3 方法

實驗室培養：將樣本進行前處理，之后放于改良羅氏培養基內進行培養。

熒光定量PCR檢測法：將樣本進行離心處理，取沉淀后滅活，再于室溫下進行離心處理，之后加入結核桿菌復合群核酸檢測試劑增強液于樣本，經提取儀提取核酸。加入TB-DNA提取液于待測樣本和陰陽對照品，分裝于8聯管孔上SLAN-96SPCR擴增。儀器PCR反應程序：先通過50℃UNG處理，維持2 min，再利用95℃UNG酶失活，預變性10 min，再Touchdown循環程序10個，PCR循環程序45個，再按照標準曲線對CT值進行計算。所用儀器分別為SLAN-96S核酸擴增儀，結核分枝桿菌培養儀BD BACTECMGMT960，培養管批號為國械準進20142405711，結核分枝桿菌復合群核酸檢驗劑批號為20112601。

1.4 觀察指標

對患者檢測結果進行觀察分析，以實驗室培養為金標準，分析熒光定量PCR法的檢驗準確度、靈敏度和特異度。準確度=（真陰例數+真陽例數）/總例數×100%；特異度=真陰例數/（真陰性例數+假陽例數）×100%；靈敏度=真陽例數/（真陽例數+假陰例數）×100%。

1.5 統計方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計數資料以例數（n）和率（%）表示，進行χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

在118例疑似結核患者中，共計156份臨床樣本。156份臨床樣本經實驗室培養檢查確診患者104份，占比66.67%，熒光定量PCR法陽性檢出率為64.10%（100份），和實驗室培養檢查結果相比，差異無統計學意義（P＞0.05）；臨床樣本熒光定量PCR法檢測的準確度、特異度、靈敏度分別為97.44%、100.00%、96.15%，見表1、表2。

表1 兩種方法陽性檢出率比較

表2 熒光定量PCR法診斷結果（n）

3 討論

結核病為傳染性疾病，全球人口流動性提升，導致結核病發病率隨之提高，我國是結核病高發國家，活動性肺結核患者人數占據全球第二，且傳染性肺結核患者人數較多，防治結核病為我國臨床研究的重點[4-5]。自抗結核病治療方案使用之后，耐藥、耐多藥結核病發生率逐漸提高，且存在雙重感染（人類免疫缺陷病毒以及結核分歧桿菌）風險，加之全球人口流動性的增強，導致結核病發生率逐漸提升，在歐美國家也發生了反彈情況。世界衛生報告組織調查表明，世界上感染結核桿菌的人數＞20億，其中活動性肺結核患者人數多于2 000萬，每年新增該疾病患者的人數多于300萬，而我國屬于結核病高發國家，其中活動性肺結核患者人數居于世界第二，據我國流行病調查結果表明，我國活動性肺結核患者數量多于600萬，傳染性肺結核患者數量在200萬之上，因此防治結核病成為醫學研究重要課題[6-7]。

結核病檢測方法主要包括直接涂片鏡檢、病原學培養，其中，涂片鏡檢以萋-納氏抗酸染色法為主，該種檢測方式簡單易操作，無需特殊設備，是該疾病病原檢查最基礎的方法，但此種方法具有較低的敏感性；而病原學診斷中，細菌培養法為診斷金標準，但該種檢驗方式檢驗用時久，易延誤疾病治療的最佳時機，且會導致疾病傳播，其最大的問題即結核分枝桿菌生長周期長[8-9]。除上述兩種檢測方法外，單克隆抗體也能夠檢出結核分歧桿菌特異抗原，進而達到診斷目的，但該種檢測方式對于痰液、胸腹水標本的檢測效果并不理想，假陽性、假陰性率較高，診斷結果并不可靠。為提升結核病診斷結果，需采取更加有效的檢驗方式。

熒光定量PCR法是一種常見的檢驗方式，檢驗模式為決定定量、相對定量，前者通過已知標準曲線計算樣本量，后者通過靶序列對于另一組參照序列變化信息計量。熒光定量PCR方法目前已被臨床醫學廣泛使用，對于（人類免疫缺陷病毒、人類皰疹病毒、巨細胞病毒以及結核桿菌等病原體檢測均具有良好檢驗效果[10]。在多種病原體的診斷中，均能夠使用PCR技術，如結核桿菌、布魯氏菌，且相關研究證實，使用PCR方法診斷結核性腦炎，可獲取結核分枝桿菌培養法和直接涂片法所無法比擬的敏感度[11-12]。熒光定量PCR技術指的是PCR反應體系內加入熒光基團，通過熒光信號累積，對整個PCR進行實時監測，最終利用標準曲線定量分析未知模板，該項技術將定時定量PCR儀、實時熒光定量試劑、通用電腦以及自動分析軟件結合起來，形成了PCR-DNA、RNA實時熒光定量檢測系統[13]。傳統PCR技術不能準確定量，操作當中容易受到污染，存在較高的假陽性率，應用受限，因此準確定量PCR產物是PCR技術的重要發展方向。熒光定量PCR技術采用全封閉反應，可以避免污染問題產生，且該種方法特異度和靈敏度更高，通過實時監控能夠更加精準地定量檢測，從而為疾病監測提供參考[14]。王純華等[15]研究中，熒光定量PCR檢測肺內樣本檢測中靈敏度與特異度分別為97.8%、97.5%，其數據均具有較高的檢測準確性；本研究中，臨床樣本熒光定量PCR法檢測的靈敏度、特異度分別為96.15%、100.00%；本研究臨床樣本熒光定量PCR法檢測結果與其研究具有一致性，說明其檢測方式具有較高的準確度，由此可見熒光定量PCR方法存在良好的檢測效果，可以提升臨床診斷準確率，利于患者疾病的有效治療，對患者治療和預后均具有積極意義。

綜上所述，熒光定量PCR方法檢測結核分枝桿菌復合群，可獲取較高的靈敏度和特異度，其檢驗準確度與實驗室培養結果相當，利于患者盡早治療，改善預后。