禁牧對內蒙古克氏針茅草原表層土壤細菌群落結構的影響

張曉馥, 白 雪, 張起迪, 李淑芬, 韓 冰,2,3, 趙鴻彬,2,3*

(1. 內蒙古農業大學生命科學學院, 內蒙古 呼和浩特 010010; 2. 麥類種質創新利用自治區高等學校重點實驗室, 內蒙古 呼和浩特 010010; 3. 內蒙古自治區生物制造重點實驗室, 內蒙古 呼和浩特 010010)

中國草原面積占國土面積的40.9%,其中,內蒙古草原是歐亞草原和中國天然草原的重要組成部分[1]。草原土壤中存在著種類豐富的微生物群落,是草原生態系統不可或缺的部分,通過其自身代謝活動參與調節土壤碳、氮和磷等元素的地球化學循環和有機物降解過程[2]。微生物作為單細胞生物,對環境的細微變化高度敏感,其中氣象條件、土壤理化性質和植被特征均可影響土壤微生物的活性、群落構成和代謝活動[3]。土壤微生物中細菌數量最多、分布最廣[4],直接參與有機物的分解等過程,促進土壤養分的循環和轉化,進而維持草原生態系統的穩定和健康。因此,細菌多樣性可以作為評價土壤質量和生態系統服務價值的重要指標[5-6]。

在草原生態系統中,氣候變化和過度放牧可導致土壤微生物豐度和多樣性變化,影響土壤養分的循環和轉化[7-8]。圍封禁牧可促進草原植被恢復和生物多樣性的提高,從而增加草原生產能力和穩定性[9-10],是草地生態管理調控的重要手段之一[11]。長期禁牧可改變土壤細菌的組成,顯著增加植被地上生物量、凋落物量、土壤養分,降低植被多樣性[12];而短期禁牧能夠改變細菌共生模式、改善草原土壤肥力、植物豐度和多樣性[13-14],對土壤細菌多樣性表現出一定的負面影響[15]。此外,在草原生態系統中,表層土壤是土壤中營養最豐富的一層,植物根系、凋落物及分泌物較多,有著很密集的微生物共存網絡,而且微生物多樣性、土壤酶活性和養分水平高于深層土壤[16-18]。長期禁牧對表層土壤細菌豐度、多樣性、土壤微生物量有著積極的影響。細菌群落的演替率在表層土壤最高[19],但短期禁牧對表層土壤微生物的影響研究較少,研究禁牧對微生物的影響,可以為草地資源的合理利用提供有用信息。

目前,現有研究主要集中在長期禁牧條件下微生物群落結構變化,而短期禁牧對微生物群落結構變化的影響的研究較少。但是,研究短期禁牧對微生物群落結構的影響有助于了解禁牧對草原生態系統的影響,為管理和保護草原提供理論依據。本研究以內蒙古克氏針茅草原為研究對象,旨在研究草原自然放牧草地轉變為禁牧草地初期表層細菌群落的變化,為繼續深入研究禁牧后表層土壤細菌群落變化提供理論依據。

1 材料方法

1.1 試驗區域概況及樣品采集

試驗樣地位于錫林郭勒正鑲白旗的克氏針茅草原,屬典型草原,地理位置42°9′14″N,115°14′39″E,海拔高度1 343 m,年均氣溫1.9℃,多年平均降水量310 mm,屬中溫帶半干旱大陸性氣候。土壤類型偏淡栗鈣土,優勢物種主要為克氏針茅(StipakryloviiRosh)、羊草(Leymuschinensis(Trin.)Tzvel.)、冷蒿(ArtemisiafrigidaWilld.)等[20]。

本試驗于2018年在自然放牧草地上分別設置放牧和禁牧2個30 m × 30 m試驗樣地,在放牧樣地內按照每年2.72 羊單位·公頃-1的放牧強度進行放牧,時長5個月(6—10月),禁牧樣地利用圍欄禁牧,兩個樣地內部分別設置了3個大小為6 m×6 m的樣區,樣區之間間隔12 m。試驗期間(2018—2020年),每年采集5次土壤樣品(6—10月的月初)。采樣時,使用直徑為8 cm的土鉆在每個樣區采集3個("S"字形)深度為0～10 cm的土壤樣品。采集的土壤樣品去除石塊、動植物殘體等雜質,使用2 mm篩子進行過濾處理。每份土樣分為2份,一份置于5 ml無菌凍存管中,放入液氮中進行速凍,并于-80℃保存,用于后續微生物群落總DNA的抽提;另份土壤樣本保存于-20℃,用于后續土壤的理化性質的測定。本文僅針對禁牧區分析放牧向禁牧轉變初期細菌的變化。

1.2 土壤理化性質的測定

測試前將儲存于-20℃的土壤樣品取出,并置于通風處風干,再過直徑1 mm的篩子。使用ST300 型pH計(美國OHAUS)按土水比1∶2.5測定土壤pH值;使用重鉻酸鉀外加熱滴定法測定有機質含量(Soil organic matter,SOM/g·kg-1)。土壤溫度(Soil temperature,ST/℃)、土壤體積含水量(Volumetric water content,VWC)由試驗區內設立的CR1000X數據采集器和CS655(Campbell Scientific Inc.,Logo,UT,USA)傳感器每日零點監測和記錄數據。

1.3 DNA提取、擴增與測序

每個土壤樣本中取0.5 g,用MagPure Soil DNA LQ Kit (Magan) 試劑盒進行微生物群落總DNA抽提,后用NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific,USA)和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的濃度和純度;使用343F(5′-TACGGRAGGCAGCAG-3′)、798R(5′-AGGGTATCTAATCCT-3′)對細菌V3-V4區進行PCR擴增,擴增程序如下:95℃預變性 3 min,30 個循環(95℃-60 s,55℃-60 s,72℃-60 s),然后 72℃延伸 10 min,在4℃進行保存。PCR反應體系為:基因組DNA 40-60 ng,上下游引物(10 μM) 1.5 μL,PCR buffer 15 μL,dNTP(10 mmol·L-1) 1 μL,Q5高保真DNA聚合酶 0.2 μL,High GC Enhancer 10 μL,ddH2O補足至50 μL,每個樣本3個重復。

將同一樣本的PCR產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物,進行回收產物純化,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用超微量核酸定量儀對回收產物進行檢測定量。通過Illumina MiSeq 2500 平臺(Illumina Int.,San Diego,CA,USA)測序生成原始雙端序列,對序列進行質控、拼接、剔除嵌合體、根據97%的相似度進行OTU(Operational taxonomic units),即操作分類單元聚類,并比對Silva數據庫,對每條序列進行物種分類注釋。

1.4 數據分析

在本試驗中OTU數代表細菌豐度,Shannon指數代表細菌多樣性。試驗測定的土壤理化性質和細菌α多樣性用SPSS 26.0進行單因素方差分析,差異顯著性為95%的置信區間,探討放牧向禁牧轉變初期對土壤理化性質及細菌群落影響及其顯著性,其中Chao1、Observed_species、Shannon、Simpson指數作為細菌α多樣性的指標;通過R包vegan分析繪制β多樣性的PCoA圖,觀察組間細菌群落組成的差異,采用adonis檢驗分析不同組間β多樣性差異的顯著性,采用Galaxy軟件的LEfSe組件分析發現不同組間具有統計學差異的物種;使用R包corrplot進行細菌群落屬性與土壤因子相關分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質和細菌α多樣性時間變化分析

隨著禁牧時間增長,土壤pH值下降,2020年pH值最低(P<0.05,圖1a)。SOM先增加后降低,2019年SOM最高,在2018—2020年間無顯著差異(圖1b)。VWC在2018—2020年先下降后上升,其中2019年VWC最小,且顯著低于2018和2020年(P<0.05),而2018年與2020年間VWC無顯著差異(圖1c)。ST先增加后降低,在2018—2020年間無顯著差異(圖1d)。

圖1 土壤理化和細菌α多樣性差異Fig.1 Differences in soil physicochemical and bacterial alpha diversity注:a,pH;b,SOM,土壤有機質,g·kg-1;c,VWC,土壤體積含水量;d,ST,土壤溫度,℃;e,分類單元;f,Chao1指數;g,Observed_species指數;h,香濃指數;i,辛普森指數;2018,自然放牧;2019,禁牧1年;2020,禁牧2年。數據間的差異顯著水平為P<0.05,下同Note:a,pH;b,SOM,Soil Organic Matter,g·kg-1;c,VWC,Volumetric Water Content;d,ST,Soil Temperature,℃;e,OTU;f,Chao1 index;g. Observed_species index;h,Shannon index;i,Simpson index;2018,Natural Grazing;2019,1 year of grazing prohibition;2020,2 year of grazing prohibition. The significant level of difference between the data is P<0.05,the same as below

細菌OTU數呈單峰趨勢,2019年數值最高,在2018—2020年間有顯著差異(P<0.05,圖1e)。多樣性指數(Chao1,Observed_species,Shannon,Simpson)均出現下降趨勢(圖1f,g,h,i),而且2020年多樣性指數與2018年和2019年的多樣性指數有顯著差異(P<0.05)。

2.2 土壤細菌群落變化及差異分析

2.2.1土壤細菌群落結構變化 對放牧向禁牧轉變初期表層土壤細菌物種組成變化進行分析發現,在門水平上,表層土壤細菌群落以放線菌門(Actinobacteria,31.56%～60.81%)、變形菌門(Proteobacteria,20.90%～35.81%)、擬桿菌門(Bacteroidetes,2.43%～14.27%)、酸桿菌門(Acidobacteria,2.30%～11.98%)為主(74.90%～92.86%)。2019年,放線菌門的豐度最大,與2018年相比升高53.60%,在2020年,變形菌門豐度超過放線菌門豐度;變形菌門、擬桿菌門的豐度隨著禁牧時間的延長而增加,在2019年分別增加26.08%,38.27%,在2020年分別增加71.33%,487.24%;酸桿菌門在2018年相對豐度最高,2019年、2020年相對豐度分別減少80.55%,80.80%(圖2a)。

圖2 細菌群落組成Fig.2 Bacterial community composition注:a,門水平下細菌群落組成的變化;b,屬水平下細菌群落組成的變化。2018,自然放牧;2019,禁牧1年;2020,禁牧2年Note:a,Changes in bacterial community composition at the phylum level;b,Changes in bacterial community composition at the genus level. 2018:Natural grazing;2019,1 year of grazing prohibition;2020,2 year of grazing prohibition

在屬水平上,表層土壤細菌群落以鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas1.65%～6.48%)、Gaiella(2.23%～2.97%)、紅色桿菌屬(Rubrobacter1.80%～3.16%)、土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter0.80%～3.13%)為優勢菌屬,鞘脂單胞菌屬的豐度隨著禁牧時間的延長,在2019年和2020年,其豐度分別增加了55.15%和292.12%;相比于2018年,Gaiella和土壤紅桿菌屬的豐度在2019年呈增加趨勢,分別增加了22.73%和151.20%,在2020年出現了下降情況均小,Gaiella的豐度下降了7.85%,土壤紅桿菌屬的豐度下降了36.00%;紅色桿菌屬的豐度在2019年中增加了74.59%,在2020年出現了下降趨勢,其相對豐度較2018年有所增加,但增幅為0.56%(圖2b)。

2.2.2表層土壤細菌群落β多樣性 采用Bray-Curtis方法,進行主坐標分析(PCoA),第一坐標軸(PC1)和第二坐標軸(PC2)可以解釋細菌組成的53.75%的組間差異,其中,PC1和PC2分別解釋了34.56%和19.19%的差異,2018年和2019年之間的差異小于2018年和2020年之間的差異。采用adonis分析確定了自然放牧向禁牧轉變初期表層土壤細菌群落組成有顯著差異(R2=0.47,P=0.001)(圖3)。

2.2.3表層土壤細菌群落結構差異分析 通過對表層土壤細菌豐度差異進行LEfSe分析發現,在LDA Score >4.0,P<0.05水平下,從2018年至2020年中相對豐度存在顯著差異的細菌共有46種。2018年酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、疣微菌門(Verrucomicrobia)等15種細菌與2019年和2020年存在顯著差異;禁牧后,在2019年,與2018年和2020年相比,放線菌門(Actinobacteria)等13種細菌的相對豐度存在顯著差異;在2020年,與2018年和2019年相比,變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)等18種細菌的相對豐度存在顯著差異(圖4)。

圖4 細菌群落組成差異Fig.4 Differences in bacterial community composition注:2018,自然放牧;2019,禁牧1年;2020,禁牧2年Note:2018,Natural grazing;2019,1 year of grazing prohibition;2020,2 year of grazing prohibition

2.3 表層土壤細菌群落屬性-土壤理化關系分析

采用Pearson相關分析方法,探究土壤理化性質與土壤細菌群落之間的相關關系,發現在2018年自然放牧環境下,BO分別與VWC和ST存在顯著的負相關和正相關關系(P<0.01),BS與VWC顯著負相關(P<0.05)(圖5a);禁牧后(2019—2020年)影響BO的主要因素發生了顯著變化,BS的相關因素也發生了一定的變化,BO與pH、SOM、ST顯著正相關(P<0.05),與VWC顯著負相關(P<0.05),BO與pH的相關性顯著增強;BS與SOM、VWC顯著相關(P<0.05),其中,BS與VWC的相關性增強(圖5b)。

圖5 放牧向禁牧轉變初期的細菌群落屬性-土壤理化相關性分析Fig.5 Analysis of bacterial community properties-soil physicochemical correlation in the early stage of grazing to grazing prohibition注:a,基于Pearson算法,自然放牧環境中(2018年)微生物與土壤因子的相關關系;b,基于Pearson算法,禁牧環境中(2019—2020年)微生物與土壤因子的相關關系。BO,細菌OTU,表示細菌豐度;BS,細菌Shannon指數,表示細菌多樣性。圖中藍色表示顯著正相關,紅色表示顯著負相關,顏色越深相關性越大,數字為相關性系數;空白表示P>0.05,無顯著相關關系;“*”,P<0.05;“**”,P<0.01;“***”,P<0.001Note:a,The correlation between microorganisms and soil factors in a natural grazing environment(2018) based on the Pearson algorithm. b,The correlation between microorganisms and soil factors in a restricted grazing environment(2019-2020) based on the Pearson algorithm. BO,Bacterial OTU,indicating bacterial abundance;BS,Bacterial Shannon index,indicating bacterial diversity. Blue color in the graph indicates significant positive correlation,red color indicates significant negative correlation,the darker the color the greater the correlation,the number is the correlation coefficient;blank indicates P>0.05,no significant correlation. “*”,P<0.05;“**”,P<0.01;“***”,P<0.001

3 討論

禁牧對過度放牧草地土壤微生物群落的恢復可產生積極的影響[21],本研究結果顯示放牧向禁牧轉變初期,表層土壤細菌中優勢菌組成沒有顯著改變,仍以放線菌門和變形菌門為主,但細菌的相對豐度產生變化,放線菌門相對豐度先增加后減少,而變形菌門相對豐度逐年增加。這可能是因為在放牧向禁牧的轉變過程中,土壤中微生物可利用的營養逐漸增加,導致微生物群落從寡養類群轉變為共養類群。放線菌門屬于寡養類群,通常更適應養分低的環境,并能耐受干旱[19],而變形菌門屬于共養類群,其豐度與碳水化合物和氨基酸代謝之間存在正相關關系,通常更適應于養分高的環境[22]。因為禁牧會使某些特定的微生物生境受到限制,進而導致某些微生物物種數量減少,并降低了細菌的α多樣性[14],這與本研究中禁牧后細菌α多樣性下降結果一致。但在朱怡等[23]的研究中,禁牧條件下細菌α多樣性高于放牧條件,由于其研究區域在江蘇大豐麋鹿保護區,地區、天氣等因素對細菌α多樣性也會產生一定的影響,因此,其中的機制需進一步探究。

土壤pH是影響細菌群落組成變化的一個重要因素[24]。在自然放牧條件下,牛羊排泄物可能會使土壤pH升高成堿性[25]。在本研究結果中,禁牧初期由于缺乏牛羊排泄物(糞便和尿液)的輸入,土壤pH呈下降趨勢。同時,在本樣地的其他研究數據表明,2018年降雨量為309 mm,2019年降雨量198.3 mm,2020年降雨量164.6 mm[26]。禁牧1年沒有牲畜啃食,植被有所恢復,并且這一年度降雨量減少,地下、地上生物量的增加同時消耗大量水分,所以導致VWC在2019年呈下降趨勢。禁牧2年植物根系更旺盛、完整,吸水能力增強,所以在禁牧2年,土壤水分有所回升[27]。由于土壤水分的變化,BO與VWC的顯著負相關關系減弱,BS與VWC的顯著負相關關系增強,對土壤微生物群落結構產生了直接的影響,并且不同的細菌對水分的響應不同,一般來說革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌耐旱性更強;其中,綠彎菌門、疣微菌門對水分變化敏感,短暫的干旱脅迫會導致其豐度降低,即便再復水也無法恢復到先前水平[28]。在本研究中,BS、BO與SOM均存在顯著正相關關系,BO與ST存在顯著正相關關系,這可能是因為禁牧條件下植物多樣性、豐富度和總蓋度增高,從一定程度上增加了土壤覆蓋率、抵御了太陽輻射,使土壤溫度降低[29]。溫度可通過影響土壤酶活性、土壤養分分解,進一步影響微生物群落尤其是細菌群落[30]。溫度對細菌豐度有顯著的影響,如厚壁菌門相對豐度隨著土壤溫度的升高而降低[31]。土壤有機質積累的主要驅動因素包括微生物殘體,微生物群落的組成和豐度也會受到有機物分解程度的影響,土壤碳與微生物群落多樣性有顯著相關關系,對草原生態系統的健康有重要的意義[32-33]。

4 結論

在放牧向禁牧轉變的初期,內蒙古克氏針茅草原的土壤pH呈下降趨勢,有機質、溫度先增加后降低,體積含水量先降低后增加。細菌群落優勢菌種未發生改變,為放線菌門和變形菌門,優勢菌種的相對豐度發生變化,放線菌門相對豐度先升高后降低,變形菌門相對豐度呈上升趨勢,細菌α多樣性下降。放牧向禁牧轉變初期,細菌群落結構組成存在顯著的差異,細菌豐度易受外部環境的影響。本研究的結果為草地管理模式改變初期對表層土壤細菌的影響提供了有用的數據信息和新的見解。