LncRNA MAFG-AS1調節miR-331-3p/SERPINE1軸對胃癌細胞惡性生物學行為的影響

宋玉濤, 王 峰, 李 凡, 馮 浩

(河北省定州市人民醫院, 河北 定州 073000)

胃癌屬于消化系統惡性腫瘤,早期缺乏癥狀,發現時多為晚期,常出現預后不良[1],因此尋找新的生物標志物或者有效的生物靶點將有助于胃癌的發現或治療。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是一種包含200多個核苷酸的非編碼RNA,可參與腫瘤轉移、癌癥細胞程序性死亡等過程[2]。研究表明重組人V-maf肌腱膜纖維肉瘤癌基因G反義RNA1(v-maf musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog G-antisense RNA1,MAFG-AS1)是一種新型致癌LncRNA,在乳腺癌、肺癌等癌癥中異常過表達,通過調節miRNA影響多種生物學效應,包括增殖、轉移、上皮間充質轉化等,被認為是一種有前景的預后生物標志物,可作為癌癥治療的潛在靶點[3-5]。MiRNA是LncRNA的主要靶標,miR-331-3p在多種癌癥中可作為潛在的腫瘤抑制因子,可以抑制胃癌細胞生長[6]。利用軟件分析發現MAFG-AS1與miR-331-3p有互補結合位點。miRNAs與特定的mRNA結合,在轉錄后負調控基因的表達[7]。SERPINE1是位于7號染色體上的基因,也稱纖溶酶原激活物抑制劑Ⅰ型(plasminogen activator inhibitor type 1,PAI-1),是一種組織型纖溶酶原激活劑和尿苷磷酸腺苷的抑制劑,其與多種腫瘤進展有關[8],利用軟件分析發現miR-331-3p與SERPINE1存在互補結合位點。基于此,本研究推測:LncRNA MAFG-AS1調節miR-331-3p/SERPINE1軸影響胃癌細胞增殖、遷移和侵襲。

1 材料與方法

1.1實驗材料:收集本院30例胃癌患者癌組織以及癌旁正常組織(距發灶邊緣5cm以上),經病理鑒定均為腺癌。本實驗獲得醫院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

1.2細胞、試劑:人胃黏膜正常上皮細胞GES-1、人胃癌細胞BGC-823、SGC-7901、MGC-803(中國科學院上海細胞庫)。本實驗所用質粒由實驗室保存;Lipo3000TM轉染試劑購自德國默克公司;CCK-8試劑盒購自美國Elabscience公司;EDU細胞增殖檢測試劑盒購自廣州銳博生物公司;Firefly &Renilla Dual Luciferase Assay Kit購自蘇州宇恒生物公司;SERPINE1、PCNA、MMP-2抗體購自德國CST公司。

1.3細胞培養:將GES-1、BGC-823、SGC-7901、MGC-803細胞置于含有10%胎牛血清的培養基中,在37℃、5% CO2的環境中培養。

1.4細胞分組與轉染:將BGC-823細胞分為ctrl組(正常培養)、pcDNA3.1組(轉染pcDNA3.1)、pcLncRNA MAFG-AS1組(轉染pcDNA3.1-MAFG-AS1)、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組(pcDNA3.1-MAFG-AS1和miR-NC共轉染)、pcLncRNA MAFG-AS1+ miR-331-3p組(pcLncRNA MAFG-AS1和miR-331-3p mimic共轉染)。將細胞轉染48h,進行后續實驗。

1.5qRT-PCR檢測MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1表達:Trizol裂解30例胃癌患者癌組織、癌旁正常組織、GES-1、BGC-823、SGC-7901、MGC-803細胞及1.4各組BGC-823細胞,提取細胞總RNA,將RNA反轉錄得到cDNA,以cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1 mRNA表達,MAFG-AS1和SERPINE1內參為GAPDH、miR-331-3p內參為U6。引物如下:MAFG-AS1正向引物序列5'-CGGGAGGAAGATAAACGGGG3';反向引物序列5'-TGACCACGGAACACCTTCAG-3'。miR-331-3p正向引物序列5'-GAGCTGAAAGCACTCCCAA-3';反向引物序列5'-CACACTCTTGATGTTCCAGGA-3'。SERPINE1正向引物序列5'-GAGGATGAAAGAAACAGCCAGCT-3';反向引物序列5'-CCCGCTATGAAATTAGATTCACGT-3'。GAPDH正向引物序列5'-CTGCCCATCTACACCTCACG-3';反向引物序列5'-CTGCCCATCTACACCTCACG-3'。U6正向引物序列5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3';反向引物序列5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。采用2-ΔΔCt計算MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1 mRNA的相對表達量。

1.6CCK-8法檢測各組BGC-823細胞活力:各組BGC-823細胞轉染48h后,向每個孔中加入CCK-8溶液,細胞培養箱繼續放置2h后,酶標儀監測450nm處吸光度。

1.7EDU法檢測各組BGC-823細胞增殖:各組BGC-823細胞轉染48h后,向每個孔中加入EDU培養基,細胞培養箱繼續放置2h后,按照EDU細胞增殖檢測試劑盒說明依次進行固定、通透、洗滌、染色、熒光檢測。

1.8Transwell檢測各組BGC-823細胞遷移和侵襲:各組BGC-823細胞轉染48h后,制成細胞懸液,加入Transwell上室,下室加入含有血清的培養基,繼續培養24h后,拭去未遷移細胞,固定,結晶紫染色,顯微鏡下觀察細胞計數。細胞侵襲實驗在上室包被基質膠,其他步驟同遷移實驗。

1.9Western blot檢測各組BGC-823細胞SERPINE1、PCNA、MMP-2表達:各組BGC-823細胞轉染48h后,棄去上清,PBS洗滌后,加入RIPA裂解液裂解細胞提取蛋白,將獲得蛋白進行定量。將蛋白進行Western blot檢測SERPINE1、PCNA、MMP-2表達,具體操作如下:跑膠,轉膜,封閉,孵育一抗,孵育二抗,ECL顯色,凝膠成像系統拍照保留圖像,Image J軟件分析蛋白灰度值。

1.10雙熒光素酶報告基因實驗:構建MAFG-AS1野生型質粒(MAFG-AS1-WT)和突變型質粒(MAFG-AS1-MUT),將MAFG-AS1-WT和MAFG-AS1-MUT分別與mimics NC或miR-331-3p mimics共轉染于BGC-823細胞,48h后,檢測熒光素酶活性。構建SERPINE1野生型質粒(SERPINE1-WT)和突變型質粒(SERPINE1-MUT),將SERPINE1-WT和SERPINE1-MUT分別與mimics NC或miR-331-3p mimics共轉染于BGC-823細胞,48h后,檢測熒光素酶活性。

2 結 果

2.1胃癌組織以及癌旁組織中MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1表達比較:與癌旁組織相比,胃癌組織中MAFG-AS1和SERPINE1 mRNA表達顯著性升高,miR-331-3p表達顯著性降低(P<0.05),見表1。

表1 胃癌組織以及癌旁組織中MAFG-AS1 miR-331-3pSERPINE1表達比較

2.2GES-1細胞與多種胃癌細胞中MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1表達比較:與GES-1細胞相比,不同胃癌細胞中MAFG-AS1、SERPINE1 mRNA表達顯著性升高,miR-331-3p表達顯著性降低(P<0.05),BGC-823細胞變化結果更顯著,故后續實驗選擇BGC-823細胞。見表2。

表2 GES-1細胞與多種胃癌細胞中MAFG-AS1 miR-331-3p SERPINE1表達比較

2.3各組BGC-823細胞MAFG-AS1、miR-331-3p、SERPINE1 mRNA水平比較:與ctrl組、pcDNA3.1組比較,pcLncRNA MAFG-AS1組MAFG-AS1、SERPINE1 mRNA表達顯著升高(P<0.05),miR-331-3p mRNA表達顯著降低(P<0.05);與pcLncRNA MAFG-AS1組、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組比較,pcLncRNA MAFG-AS1+miR-331-3p組miR-331-3p mRNA表達顯著升高(P<0.05),SERPINE1 mRNA表達顯著降低(P<0.05),LncRNA MAFG-AS1表達變化無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 各組BGC-823細胞MAFG-AS1 miR-331-3p SERPINE1 mRNA水平比較

2.4各組BGC-823細胞活力比較:與ctrl組、pcDNA3.1組比較,pcLncRNA MAFG-AS1組BGC-823細胞活力A值升高(P<0.05);與pcLncRNA MAFG-AS1組、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組比較,pcLncRNA MAFG-AS1+miR-331-3p組BGC-823細胞活力A值降低(P<0.05),見表4。

表4 各組BGC-823細胞活力A值比較

2.5各組BGC-823細胞增殖能力比較:與ctrl組、pcDNA3.1組比較,pcLncRNA MAFG-AS1組BGC-823細胞EDU陽性細胞率升高(P<0.05);與pcLncRNA MAFG-AS1組、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組比較,pcLncRNA MAFG-AS1+miR-331-3p組BGC-823細胞EDU陽性細胞率降低(P<0.05),見圖1。

2.6各組BGC-823細胞遷移和侵襲能力比較:與ctrl組、pcDNA3.1組比較,pcLncRNA MAFG-AS1組BGC-823細胞遷移和侵襲數量升高(P<0.05);與pcLncRNA MAFG-AS1組、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組比較,pcLncRNA MAFG-AS1+miR-331-3p組BGC-823細胞遷移和侵襲數量降低(P<0.05),見圖2、3。

圖2 Transwell檢測各組BGC-823細胞遷移

圖3 Transwell檢測各組BGC-823細胞侵襲

2.7各組BGC-823細胞SERPINE1、PCNA、MMP-2表達比較:與ctrl組、pcDNA3.1組比較,pcLncRNA MAFG-AS1組BGC-823細胞SERPINE1、PCNA、MMP-2蛋白水平升高(P<0.05);與pcLncRNA MAFG-AS1組、pcLncRNA MAFG-AS1+miR-NC組比較,pcLncRNA MAFG-AS1+miR-331-3p組BGC-823細胞SERPINE1、PCNA、MMP-2蛋白水平降低(P<0.05),見圖4。

圖4 各組BGC-823細胞SERPINE1、PCNA、MMP-2蛋白表達比較

2.8MAFG-AS1和miR-331-3p、miR-331-3p和SERPINE1的關系:軟件分析發現LncRNA MAFG-AS1與miR-331-3p、miR-331-3p與SERPINE1均有互補結合位點,見圖5A、5B。雙熒光素酶實驗結果顯示,與MAFG-AS1-WT+mimics NC組相比,MAFG-AS1-WT+miR-331-3p mimics組BGC-823細胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與MAFG-AS1-MUT+mimics NC組相比,MAFG-AS1-MUT+miR-331-3p mimics組BGC-823細胞熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05),見圖5C。與SERPINE1-WT+mimics NC組相比,SERPINE1-WT+miR-331-3p mimics組BGC-823細胞熒光素酶活性降低(P<0.05);與SERPINE1-MUT+mimics NC組相比,SERPINE1-MUT+miR-331-3p mimics組BGC-823細胞熒光素酶活性差異無統計學意義(P>0.05),見圖5D。

圖5 驗證MAFG-AS1和miR-331-3p、miR-331-3p和SERPINE1的關系

3 討 論

LncRNA MAFG-AS1是MAFG的反義RNA,其通過海綿化miR-505上調PLK1,促進胃癌細胞增殖[9];MAFG-AS1調控miR-143-3p/AKT2軸促進胃癌進展[10],因此研究MAFG-AS1在胃癌進展中發揮的作用具有重要意義,可為胃癌診斷和治療提供新的靶點。本文首先發現胃癌組織中MAFG-AS1、SERPINE1表達顯著升高,miR-331-3p表達顯著降低。隨后選取人胃黏膜正常上皮細胞以及胃癌細胞同樣檢測三者表達,本文發現與人胃黏膜正常上皮細胞GES-1相比,多種胃癌細胞中MAFG-AS1過表達,與臨床樣本的研究結果一致,且BGC-823細胞中MAFG-AS1表達量最高,因此后續實驗選擇BGC-823細胞。進一步研究表明,過表達MAFG-AS1通過提高增殖相關蛋白PCNA、遷移侵襲相關蛋白MMP-2水平促進BGC-823細胞增殖,侵襲和遷移,表明MAFG-AS1在胃癌發展中發揮促癌作用。

多個研究表明miR-331-3p參與胃癌的發展,比如LncRNA MIAT通過海綿化miR-331-3p促進胃癌增殖和轉移[6];circCACTIN抑制miR-331-3p水平促進胃癌細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT[11],上述研究表明miR-331-3p是胃癌中潛在的腫瘤抑制因子。本研究中同樣發現,與GES-1細胞相比,胃癌細胞中miR-331-3p表達顯著性下調,隨后發現過表達MAFG-AS1顯著抑制miR-331-3p表達。本研究利用軟件預測發現MAFG-AS1與miR-331-3p存在結合位點,且雙熒光素酶實驗結果證實了這一預測。更重要的是,將MAFG-AS1與miR-331-3p共轉染后可減弱由MAFG-AS1引起的促癌作用,提示MAFG-AS1和miR-331-3p確實存在互作關系,說明MAFG-AS1可靶向負調控miR-331-3p進而促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲。

本文觀察到與GES-1細胞相比,SERPINE1在胃癌細胞中高表達,且與miR-331-3p表達呈負相關,二者的表達趨勢與軟件的預測結果及雙熒光素酶報告基因檢測結果一致,提示miR-331-3p可能靶向調控SERPINE1表達。SERPINE1在胃癌組織中高表達,影響胃癌細胞的侵襲和遷移,有研究表明SERPINE1可作為胃腺癌促癌基因,調節EMT促進腫瘤細胞增殖,遷移和侵襲[12]。上述研究表明SERPINE1促進胃癌發展,本文結果與上述結果一致。本文發現過表達MAFG-AS1可促進SERPINE1表達,MAFG-AS1和miR-331-3p共轉染后可抑制MAFG-AS1對SERPINE1表達的促進作用,提示MAFG-AS1可通過靶向調控miR-331-3p/SERPINE1軸促進胃癌細胞增殖、遷移、侵襲。

總之,本研究發現在胃癌細胞中MAFG-AS1高表達,進一步研究表明MAFG-AS1促進BGC-823細胞增殖,侵襲和遷移;相關機制研究表明,MAFG-AS1可調節miR-331-3p/SERPINE1軸促進胃癌細胞惡性發展,本研究為胃癌的發現或者治療提供新的視角。然而本研究尚存在不足之處,缺乏回復性實驗,驗證下調SERPINE1表達,對BGC-823細胞增殖、遷移和侵襲的影響,將作為下一步研究重點。