西洋參總皂苷通過Nrf2-ARE通路對壓力性尿失禁的治療作用

楊丹丹, 唐紅英, 張 蝶, 魏國斌, 張靖雪, 李南希

(四川省廣安市人民醫院婦科, 四川 廣安 638000)

壓力性尿失禁(Stress urinary incontinence,SUI)是指在咳嗽、噴嚏等腹壓增加時,尿液不自主的從尿道口流出的現象[1]。調查顯示[2-3],我國SUI成年女性患病率約為20%,嚴重影響女性的身心健康和生活質量。近年來研究發現,盆底組織氧化應激可能是SUI防治研究的有效靶點[4]。核因子E2相關因子(Nuclear-factor-E2-related factor,Nrf2)/抗氧化反應元件(antioxidant response element,ARE)信號是機體內可防御氧化應激損傷的通路之一,其可介導多種疾病的發生發展,包括腫瘤、炎癥、神經系統疾病、自身免疫性疾病等[5]。目前已有研究證實,Nrf2/ARE信號通路可調節細胞和組織抗損傷能力,并對損傷修復和組織重建等過程發揮促進作用[6]。因此猜測Nrf2/ARE信號通路可能對SUI盆底組織損傷發揮保護作用。西洋參又稱為花旗參,其性寒,以養陰生津作用為主[7]。西洋參總皂苷(PQS)是西洋參主要有效活性成分之一,現代藥理研究表明,其具有提高機體免疫力、抗心肌缺血、抗腫瘤、降血糖和血脂、改善認知等多種藥理學作用[8]。近年來有研究發現,人參皂苷Rb1對壓力性尿失禁尿道組織損傷可發揮促進作用,但目前關于西洋參總皂苷對SUI的作用報道較少[9]。因此本研究旨探究西洋參總皂苷通過Nrf2/ARE通路對壓力性尿失禁的治療作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物:60只雌性未育SD大鼠均購自廣州銳格生物科技有限公司,許可證號:SCXK(粵)2021-0059。大鼠體質量為200g～220g,將大鼠統一飼養在動物房內,溫度為23～25℃,空氣相對濕度為50%,光照12h/12h晝夜交替,自由飲水攝食,適應性喂養1周。

1.2試劑和儀器:西洋參總皂苷(純度≥98%,陜西昂煦生物科技有限公司);Nrf2特異性抑制劑ML385(美國MedChem Express公司);Nrf2抗體、醌氧化還原酶1(HO-1)抗體、血紅素加氧酶1(NOQ1)抗體(武漢愛博泰克生物科技有限公司);烏拉坦(上海山浦化工頭有限公司);蘇木素-伊紅染色液(美國Sigma公司);中性樹膠(武漢塞維爾生物科技有限公司);qRT-PCR試劑盒(日本TaKaRa公司);6-Fr弗萊氏尿管(大連庫利艾特醫療制品有限公司);尿動力學檢測儀(Nidoc 970A,成都維信電子科大新技術有限公司)。

1.3分組及模型制備:將60只大鼠隨機分為Control組、SUI組、PQSL組、PQSM組、PQSH組和PQSH+ML385組,每組10只。Control組大鼠不做任何處理,其余各組根據參考文獻[10]制備SUI大鼠模型,膀胱內插入導管排空尿液,后在腹部的正中位切開1cm的小口,剝離雙側卵巢組織后縫合,將導管置于陰道處,將3mL的無菌生理鹽水用氣囊注入陰道,讓陰道充分的擴張,4h后將尿導管撤掉,當陰道氣囊擴張2周后完全摘除卵巢組織后縫合。通過噴嚏實驗驗證模型制備是否成功。造模成功后,PQSL組、PQSM組、PQSH組大鼠分別灌胃50mg/kg、100mg/kg、200mg/kg的西洋參總皂苷;PQSH+ML385組大鼠灌胃200mg/kg的西洋參總皂苷,同時經尿道壁注射10μL的Nrf2特異性抑制劑ML385;Control組和SUI組大鼠灌胃等量的生理鹽水。每組大鼠每天灌胃1次,共計灌胃6周。

1.4噴嚏實驗:藥物干預結束后,仰臥位固定大鼠,將尿道口將硬膜外導管一端插入到膀胱,另一端和微量泵鏈接,將生理鹽水注入到膀胱中,注射速度10mL/h,當尿道口有液體溢出時停止注入,計算注入量。再次將大鼠的膀胱排空,將前次1/2的生理鹽水注入到膀胱中,用鼠須刺激大鼠的鼻孔,當大鼠噴嚏發生時尿道口有液體流出時則視為噴嚏實驗陽性,如尿道口沒有液體流出則視為陰性,最后統計30min內各組大鼠噴嚏陽性率=噴嚏陽性數量/噴嚏總數量×100%。

1.5尿動力學指標檢測:排空大鼠膀胱液體,生理鹽水以每分鐘100μL的速度注入到膀胱中,當觀察大鼠尿道口出現的第一滴尿液時,統計大鼠的膀胱最大容積(maximum bladder capacity,MBC)和漏尿點壓力(leak point pressure,LPP)。再次排空大鼠膀胱,上述同樣的方法注入生理鹽水,后用手指緩慢的按壓大鼠的腹部,直至尿道口有液體排除時停止腹部按壓,記錄腹壓漏尿點壓(abdominal leakage pressure point,ALPP)。

1.6膀胱內壓測定:消毒三通管,在大鼠左側靜脈內置入三通管中的一根作為給藥途徑,縫合并固定。取另外一根導管和壓力檢測器相連接,測定各組大鼠膀胱內壓力。最后一根導管持續注入生理鹽水誘導大鼠膀胱收縮排尿,收集各組大鼠的尿液,計算大鼠的排尿量、殘余尿量及排尿效率。

1.7Masson染色:取上述組織切片固定Bouin's溶液中,56℃烤箱烘烤1h,后取出切片,將組織切片上殘留的Bouin's溶液用流水沖洗干凈,蘇木素染色10min,后蒸餾水沖洗切片;用Biebrich Scarlet酸性品紅液中染色10min,后蒸餾水再次沖洗。將組織切片置于鉬鎢酸溶液分色10～15min,當觀察到膠原的紅色褪去后終止染色。后于苯胺藍染液染色5min,于1%醋酸中分色3min,乙醇脫水后封片。

1.8尿道組織氧化應激指標檢測:取尿道組織充分研磨,制成10%組織均漿液。常溫3000r/min離心10min,收集上清液,用酶聯免疫檢測試劑盒和可見光分光光度計測定各組大鼠尿道組織中氧化應激指標,MDA、SOD、GSH-Px水平。

1.9蛋白質印跡檢測腦組織中Nrf2、HO-1、NOQ1蛋白表達:收集尿道組織,提取組織中總蛋白,用DAB法檢測總蛋白濃度。將蛋白溶液終濃度配制為2μg/mL,將蛋白溶液置于熱水中煮沸10min,后保存在-20℃冰箱中。將30μg的蛋白樣品用200V電壓電泳,轉移蛋白樣品與PVDF膜上,用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h,將一抗Nrf2、HO-1、NOQ1(1∶1000)加入到PVDF膜上,孵育一抗在在4℃環境中過夜;流水沖洗PVDF膜,將二抗(1∶1000)加入到PVDF膜上,室溫孵育2h。ECL放光液加入到細胞中,曝光顯影后用Image Lab軟件分析條帶灰度值。

2 結 果

2.1噴嚏實驗結果比較:Control組大鼠噴嚏實驗均為陰性。造模50只大鼠均出現了噴嚏實驗陽性,本研究壓力性模型大鼠制備成功。藥物干預6周后,PQSL組、PQSM組、PQSH組噴嚏實驗陽性率分別為60%(6/10)、40%(4/10)、20%(2/10),PQSH+ML385組大鼠噴嚏實驗陽性率為70%(7/10),SUI組大鼠噴嚏實驗陽性率為80%(8/10)。

2.2各組大鼠尿動力學指標比較:和Control組相比,SUI組大鼠MBC(1.36±0.12)、LPP(9.86±0.95)、ALPP(10.23±1.08)水平明顯降低(P<0.05);和SUI組相比,PQSL組(2.18±0.20)(15.31±0.15)(17.62±1.56)、PQSM組(4.11±0.35)(21.36±1.89)(25.33±2.16)、PQSH組(6.11±0.54)(34.26±3.17)(33.74±3.29)大鼠MBC、LPP、ALPP水平均明顯增加,且呈濃度依賴(P<0.05);和PQSH組相比,PQSH+ML385組大鼠MBC(1.42±0.14)、LPP(10.01±1.02)、ALPP(11.23±1.12)水平明顯降低(P<0.05),見圖1。

圖1 各組大鼠尿動力學指標比較

2.3各組大鼠膀胱內壓相關指標比較:和Control組相比,SUI組大鼠排尿量(128.69±10.51)和殘余尿量(4.12±1.06)增多,排尿效率(28.61±2.35)降低(P<0.05);和SUI組相比,PQSL組、PQSM組、PQSH組(67.38±6.12)(1.13±0.28)(82.34±5.61)大鼠排尿量和殘余尿量均減少,排尿效率增加,且呈劑量依賴(P<0.05);和PQSH組相比,PQSH+ML385組大鼠排尿量(105.16±10.23)和殘余尿量(4.05±1.02)增多,排尿效率(29.47±2.41)降低(P<0.05),見圖2。

圖2 各組大鼠膀胱內壓相關指標比較

2.4各組大鼠尿道組織膠原纖維病理學變化比較:Control組大鼠尿道與陰道壁之間包裹著連續而密集的膠原纖維;和Control組相比,SUI組大鼠尿道與陰道壁之間膠原纖維明顯減少,膠原纖維有明顯的溶解和疏松;和SUI組相比,PQSL組、PQSM組、PQSH組大鼠尿道與陰道壁之間膠原纖維量明顯增加,纖維排列逐漸整齊且緊密,呈劑量依賴;和PQSH組相比,PQSH+ML385組大鼠尿道與陰道壁之間膠原纖維量減少,且大量膠原纖維溶解(圖3)。

2.5各組大鼠氧化應激水平比較:SUI組大鼠尿道組織中MDA含量(5.97±1.23)高于Control組,GSH-Px含量(21.07±1.82)和SOD活性(41.08±2.25)低于Control組(P<0.05);和SUI組相比,PQSL組、PQSM組、PQSH組(2.18±0.65)(31.68±2.02)(74.21±3.26)大鼠尿道組織中MDA含量增加,GSH-Px含量和SOD活性明顯增加,且呈劑量依賴(P<0.05);和PQSH組相比,PQSH+ML385組尿道組織中MDA含量(5.91±1.20)增加,GSH-Px含量(37.28±2.16)和SOD活性(42.14±2.30)明顯降低(P<0.05)(圖4)。

圖4 各組大鼠氧化應激指標比較

2.6各組大鼠尿道組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達比較:和Control組相比,SUI組大鼠尿道組織中Nrf2(0.23±0.03)、HO-1(0.40±0.04)、NQO1(0.31±0.04)蛋白表達明顯降低(P<0.05);和SUI組相比,PQSL組、PQSM組、PQSH組(0.81±0.09)(0.90±0.09)(0.76±0.08)大鼠尿道組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達均明顯升高,且呈劑量依賴(P<0.05);和PQSH組相比,PQSH+ML385組大鼠尿道組織中Nrf2(0.28±0.03)、HO-1(0.31±0.03)、NQO1(0.33±0.04)蛋白表達均明顯降低(P<0.05)(圖5)。

圖5 各組大鼠尿道組織中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達比較

3 討 論

現代醫學研究表明,壓力性尿失禁是尿道對尿液失去調控作用的功能性障礙疾病[11]。SUI的發病機制復雜,有學者研究發現,SUI主要由妊娠、陰道分娩等因素導致的盆底組織松弛、陰道結締組織支撐減少及尿道內括約肌功能障礙密切相關[12]。SUI在臨床上主要的病理表現為尿頻尿急、急迫性尿失禁等不自主漏尿現象[13]。美國泌尿學會研究發現,手術治療雖然對多數SUI患者長期有效,但極易術后創傷、尿急、尿困難等并發癥,因此非手術療法是輕、中度SUI患者治療的首選[14]。但目前臨床上α1腎上腺素受體激動劑米多君等藥物治療SUI,其不僅費用高昂且不良反應較多,使其治療在臨床受到一定限制[15]。幾千年來,中藥在預防和治療疾病中發揮了中藥作用。中醫將SUI歸為歸屬為“小便不禁”、“遺尿”等范圍,多為腎氣虛弱,膀胱不固等因素所致,治療時應當補腎固攝。中醫學認為盆腔器官脫落為“陰挺”,主要發病機制為氣虛下陷,治療時應當提升益氣,補中固脫。產婦生產后一般氣血虧虛,腎氣不固,膀胱失約,進而導致遺尿的發生,治療遺尿應在于培補腎氣、固攝膀胱。西洋參是人參屬多年生草本植物,含人參皂苷、多糖、酚類、類黃酮、維生素等,中醫研究發現,西洋參具有補腎益精的作用。西洋參總皂苷對SUI大鼠的具體作用機制尚不明確,因此本研究通過制備壓力性尿失禁大鼠模型探究西洋參總皂苷對大鼠的作用機制。

尿道括約肌是泌尿系統基本結構與功能單位,異常的尿道括約肌細胞結構和功能和壓力性尿失禁的發生發展密切相關。研究顯示,當尿道括約肌細胞凋亡大量凋亡、且肌小節結構與功能異常時,會通過減少具有收縮功能的肌細胞及減弱單位肌纖維收縮能力而降低尿道括約肌功能及控尿能力。本研究結果顯示,SUI組大鼠MBC、LPP、ALPP水平和排尿效率降低,排尿量和殘余尿量增多,且膠原纖維減少;西洋參總皂苷干預后發現大鼠MBC、LPP、ALPP水平和排尿效率增加,排尿量和殘余尿量減少,膠原纖維增加,提示西洋參總皂苷可改善SUI大鼠膀胱排尿功能,減輕尿道組織損傷。張凱敏等研究證實,西洋參總皂苷可抑制SUI大鼠尿道損傷并對排尿功能可發揮改善作用。

衰老和機械應激均可引起成纖維細胞活性氧大量生成而導致氧化應激,也是引起功能障礙性疾病的重要致病因素,包括壓力性尿失禁。有研究發現,和正常小鼠相比,SUI小鼠陰道前臂組織氧化損傷產物水平明顯升高。機械刺激也可引起細胞ROS生成增加,ROS的過量積累會導致氧化應激進而導致組織和細胞發生氧化應激損傷。提示,SUI患者陰道組織存在氧化應激,由此猜測氧化應激可能與SUI的發生發展密切相關。本研究結果顯示,SUI組大鼠尿道組織中MDA含量增加,GSH-Px含量和SOD活性降低,提示SUI大鼠存在氧化應激損傷,和上述研究結果一致。研究發現,Nrf2/ARE通路可通過促進一系列抗氧化劑因的表達而增強細胞的ROS清除能力。Nrf2在正常情況下會結合Keap1,以二聚體的形式存在于胞漿中,保持細胞處于穩定狀態。當細胞處于氧化應激損傷時,Nrf2與Keap1解離進入到細胞核,通過與ARE啟動子部位結合啟動NQO1、HO-1等抗氧化基因的表達,進而發揮抗氧化損傷的作用。本研究結果顯示,SUI組大鼠Nrf2、HO-1、NQO1蛋白表達均降低,進一步證實SUI大鼠存在氧化應激損傷。本研究通過藥物干預后發現,西洋參總皂苷可能通過改善SUI大鼠氧化應激損傷而抑制尿道損傷,改善排尿功能。為了進一步驗證這一猜想,本研究同時給予SUI大鼠高劑量的西洋參總皂苷和Nrf2特異性抑制劑ML385干預,結果顯示,ML385可減弱西洋參總皂苷抑制SUI大鼠尿道損傷、改善氧化應損傷和排尿功能的作用。因此提示西洋參總皂苷可能通過激活Nrf2/ARE信號減輕SUI大鼠尿道氧化應激損傷,改善排尿功能。

綜上所述,西洋參總皂苷可通過激活Nrf2/ARE信號通路改善壓力性尿失禁排尿功能,從而對壓力性尿失禁達到治療作用。