木犀草素對變應(yīng)性鼻炎大鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

王會會 張東江 劉國旗 程耀輝 紀(jì)曉丹 陳永娜

變應(yīng)性鼻炎(AR)是一個重大的健康問題,影響著全世界約500億人[1]。AR被認為是由遺傳和環(huán)境因素引起的免疫性疾病[2],由鼻黏膜炎癥引發(fā)。人們普遍認為,致敏是由輔助性T細胞(Th)2激活和Th1細胞反應(yīng)不足,對入侵的變應(yīng)原應(yīng)激反應(yīng)造成的過敏性炎癥。改善Th1/Th2平衡被認為是緩解AR癥狀的有效方法[3]。木犀草素(Lut)是一種典型的類黃酮化合物,具有抗炎、抗過敏和增強免疫力的功能。Lut可以通過調(diào)控Th1和Th2細胞分化緩解特應(yīng)性皮炎小鼠皮膚癥狀[4]。Dong等[5]發(fā)現(xiàn),Lut可以通過改善炎癥和Th2/Th4對AR大鼠起到治療效果。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路是研究抗炎和免疫調(diào)節(jié)的常見通路,在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、牛皮癬、過敏性接觸性皮炎等疾病中已得到研究[6]。Duan等[7]發(fā)現(xiàn),抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可以改善AR小鼠癥狀。而Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn),Lut可以通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路減輕哮喘氣道炎癥和超敏反應(yīng)。本文探討Lut通過調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號通路對AR大鼠炎性反應(yīng)以及Th1/Th2平衡產(chǎn)生積極影響,報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6周齡雄性SPF級SD雄性大鼠(220±20) g,生產(chǎn)許可證號:SCXK(粵)2021-0059,購自廣州銳格生物科技有限公司,本研究嚴(yán)格遵循3R原則,在飼喂過程中,大鼠均自由采食和飲水。溫度:23～25℃,12 h明暗交替。

1.2 主要材料 Lut購自上海韻泰信息科技有限公司;PI3K/Akt/mTOR通路激活劑740 Y-P購自MedChemExpress LLC;白介素4(IL-4)試劑盒、白介素13(IL-13)試劑盒、卵清蛋白特異性IgE(OVA sIgE)試劑盒購自博輝生物科技(廣州)有限公司;干擾素(INF-γ)試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司;T-bet、GATA-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、mTOR等抗體均購自Abcam。

1.3 動物模型 隨機選擇12只大鼠作為對照組,其他大鼠參考文獻[9]建立AR模型,將大鼠通過腹腔注射卵白蛋白抗原佐劑混懸液[1 ml 0.9%氯化鈉溶液含有0.3 mg卵白蛋白和30 mg Al(OH)3],1次/2 d,連續(xù)處理2周。2周后用100 μl 10%的卵白蛋白溶液滴鼻,每側(cè)50 μl,連續(xù)滴鼻1周,觀察大鼠打噴嚏、抓鼻子以及流鼻涕的情況,當(dāng)行為學(xué)評分總值≥5分時,造模成功。見表1。

表1 行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)

1.4 分組與處理 將造模成功的大鼠隨機分為AR組、Lut組、740 Y-P組、Lut+740 Y-P組,每組12只。Lut組通過腹腔注射1 mg/kg的Lut,1次/d,連續(xù)注射2周[5]。740 Y-P組通過腹腔注射10 mg/kg PI3K/Akt/mTOR通路激活劑740 Y-P[10],1次/d,連續(xù)注射2周。Lut+740 Y-P組在腹腔注射1mg/kg Lut的基礎(chǔ)上注射10 mg/kg 的740 Y-P,1次/d,連續(xù)注射2周。對照組和AR組注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.5 標(biāo)本采集 行為學(xué)評分后,對不同組的大鼠腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉以誘導(dǎo)完全麻醉。然后,收集鼻腔灌洗液,收集外周血用于流式細胞術(shù)檢測,通過腹主動脈收集2 ml血液,離心機3 000 r/min離心15 min,血清用于酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測。隨后將大鼠處死收集鼻黏膜組織,6只鼻黏膜組織固定于4%多聚甲醛中用于病理檢測,6只大鼠鼻黏膜組織用于Western blot檢測。

1.6 ELISA試劑盒檢測細胞因子水平 根據(jù)ELISA試劑盒說明書測定鼻腔灌洗液中IL-4、IL-13和INF-γ的表達,以及血清中OVA-sIgE的表達。

1.7 流式細胞術(shù)檢測Th1/Th2 根據(jù)大鼠外周血淋巴細胞分離試劑盒從血液樣本中分離大鼠的外周血單個核細胞(PBMC),將50 μl PBMC懸浮液與10 μl PE偶聯(lián)的抗大鼠CD3和10 μl APC偶聯(lián)的抗大鼠CD4抗體在37℃、5% CO2孵育30 min,加入1 ml紅細胞裂解液共同孵育,然后離心除去上清液,并在黑暗中用APC標(biāo)記的抗大鼠FITC-IFN-γ或eFluor660-IL-4孵育10 min。通過流式細胞術(shù)檢測Th1細胞(定義為CD3+、CD4+、IFN-γ+)和Th2細胞(定義為CD3+、CD4+、IL-4+),并使用CellQuest軟件分析數(shù)據(jù)。

1.8 HE染色檢測鼻黏膜組織病理學(xué) 鼻黏膜組織用0.9%氯化鈉溶液洗滌,在10%多聚甲醛溶液中固定24 h。用石蠟包埋,旋轉(zhuǎn)切片機切片至5 μm。1%蘇木精和1%伊紅染料染色,封片后用顯微鏡觀察黏膜組織病理變化。

1.9 Western blot檢測T-bet、GATA-3以及PI3K/Akt/mTOR通路相關(guān)蛋白表達 用RIPA裂解緩沖液從鼻黏膜組織中提取細胞裂解物。根據(jù)BCA試劑盒定量蛋白質(zhì)濃度。通過12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量蛋白質(zhì)(10 μg/泳道),并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶封閉后,將膜與一抗T-bet(1∶1 000)、GATA-3(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、p-PI3K(1∶2 000)、AKT(1∶1 000)、p-AKT(1∶1 000)、mTOR(1∶1 000)和GAPDH抗體(1∶1 000),4℃孵育一夜;加入二抗,室溫孵育1 h,加入ECL顯影后。使用Image J軟件分析目的蛋白灰度值。

2 結(jié)果

2.1 Lut對大鼠行為學(xué)評分的影響 與對照組相比,AR組行為學(xué)評分顯著增加(P<0.05);與AR組相比,Lut組行為學(xué)評分顯著減少(P<0.05),而740 Y-P組趨勢相反(P<0.05);與Lut組相比,Lut+740 Y-P組行為學(xué)評分顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠行為學(xué)評分比較 n=12,分,

2.2 Lut對大鼠細胞因子水平的影響 與對照組相比,AR組大鼠IL-4、IL-13和OVA-sIgE水平顯著增加(P<0.05),INF-γ水平顯著降低(P<0.05);與AR組相比,Lut組IL-4、IL-13和OVA-sIgE水平顯著減少(P<0.05),INF-γ水平顯著增多(P<0.05),而740 Y-P組趨勢相反(P<0.05);與Lut組相比,Lut+740 Y-P組IL-4、IL-13和OVA-sIgE水平顯著升高(P<0.05),INF-γ水平顯著下降(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠細胞因子水平比較 n=12,

2.3 Lut對大鼠Th1/Th2水平的影響 與對照組相比,AR組大鼠Th1水平顯著降低(P<0.05),Th2水平顯著增加(P<0.05);與AR組相比,Lut組大鼠Th1水平顯著增加(P<0.05),Th2水平顯著減少(P<0.05),而740 Y-P組趨勢相反(P<0.05);與Lut組相比,Lut+740 Y-P組Th1水平顯著降低(P<0.05),Th2水平顯著增加(P<0.05)。見表4,圖1。

對照組 AR組 Lut組 740 Y-P組 Lut+740 Y-P組

表4 5組大鼠Th1/Th2水平比較 n=12,

2.4 Lut對大鼠病理變化的影響 對照組大鼠鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)正常,與對照組相比,AR組組織上皮紊亂、細胞剝落、固有層嗜酸性粒細胞浸潤、腺體腫脹和黏膜下血管充血;與AR組相比,Lut組大鼠嗜酸性粒細胞浸潤減少,上皮排列有序,鼻黏膜細胞剝落減少,而740 Y-P組加重上述病理表現(xiàn);Lut+740 Y-P組鼻黏膜損傷與AR組相似。見圖2。

2.5 Lut對大鼠T-bet、GATA-3蛋白水平的影響 與對照組相比,AR組T-bet蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05),GATA-3蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05);與AR組相比,Lut組T-bet蛋白水平顯著升高(P<0.05),GATA-3蛋白水平顯著下降(P<0.05),而740 Y-P組趨勢相反(P<0.05);與Lut組相比,Lut+740 Y-P組T-bet蛋白水平顯著下調(diào)(P<0.05),GATA-3蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖3,表5。

圖3 Western blot檢測T-bet/GATA-3信號通路蛋白水平

表5 Lut對大鼠T-bet/GATA-3信號通路蛋白水平的影響 n=6,

2.6 Lut對大鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白水平的影響 與對照組相比,AR組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白水平顯著上調(diào)(P<0.05);與AR組相比,Lut組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白水平顯著降低(P<0.05),而740 Y-P組趨勢相反(P<0.05);與Lut組相比,Lut+740 Y-P組p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白水平顯著升高(P<0.05)。見表6,圖4。

圖4 Western blot檢測PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白水平

表6 Lut對大鼠PI3K/Akt/mTOR信號通路蛋白水平的影響 n=6,

3 討論

AR是由IgE介導(dǎo)的炎癥性鼻腔疾病,由敏感個體暴露于變應(yīng)原引起[11]。據(jù)估計,AR在兒童中的患病率為2%～25%,在成年人中為1%～40%;歐洲成年人中確診AR的患病率在17%～28.5%[12]。近年來,隨著空氣污染的加劇和環(huán)境惡化,AR的發(fā)病率明顯增加。有效、安全地治療AR越來越受到重視。本研究中,我們通過使用卵白蛋白成功建立了AR大鼠模型。與對照組相比,AR組大鼠病理檢查顯示上皮紊亂、細胞剝落、固有層嗜酸性粒細胞浸潤、腺體腫脹和黏膜下血管充血,打噴嚏、抓鼻子次數(shù)增加以及滿面鼻涕,提示AR大鼠造模成功。Lut是一種類黃酮,被認為是紫蘇的抗過敏成分,在亞洲國家,它是一種治療過敏性疾病的流行草藥。有研究報道,Lut通過抑制AR小鼠和AR患者外周血中IL-4表達來減輕AR炎癥[13]。本研究結(jié)果顯示,與AR組相比,Lut組大鼠嗜酸性粒細胞浸潤減少,上皮排列有序,鼻黏膜細胞剝落減少,行為學(xué)評分顯著減少,進一步證實Lut可以對AR大鼠起到治療效果。

Th1/Th2比例失衡被認為在AR的病理生理學(xué)中起著關(guān)鍵作用,AR的特征是Th2免疫反應(yīng)增強[14]。此外,IL-4和IL-13是典型的Th2型細胞因子,可刺激B細胞的Th2分化和IgE產(chǎn)生[15],它們通過參與Th2炎性反應(yīng)在過敏性氣道炎癥中發(fā)揮關(guān)鍵作用。T-bet和GATA-3分別是Th1和Th2的轉(zhuǎn)錄因子[16]。本研究發(fā)現(xiàn),與AR組相比,Lut組大鼠IL-4、IL-13和OVA-sIgE水平、Th2水平、GATA-3蛋白水平顯著增加,Th1水平、T-bet蛋白水平顯著減少,而Lut治療后AR大鼠IL-4、IL-13和OVA-sIgE水平、Th2水平、GATA-3蛋白水平顯著降低,Th1水平、T-bet蛋白水平顯著增加,表明Lut可能通過調(diào)節(jié)Th1/Th2水平來抑制炎癥的發(fā)生,以此緩解AR。

PI3K/Akt/mTOR是氣道過敏小鼠免疫治療涉及的常見通路[17]。PI3K/Akt/mTOR信號通路抑制劑可以減弱哮喘癥狀,在氣道保護中發(fā)揮重要作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路可以恢復(fù)AR小鼠Th1/Th2平衡,改善肺部炎癥[6]。本研究發(fā)現(xiàn),AR組大鼠p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白水平顯著增加,而Lut抑制了p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、mTOR蛋白水平,暗示Lut可能通過下調(diào)PI3K/Akt/mTOR通路起到治療AR的效果。為了進一步證實我們的猜測,我們用PI3K/Akt/mTOR信號通路激活劑740 Y-P處理AR大鼠以及Lut治療的AR大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn),740 Y-P加重了AR癥狀,且740 Y-P消除了Lut對大鼠AR的治療效果。

綜上所述,Lut可能通過下調(diào)PI3K/Akt/mTOR信號通路改善AR大鼠Th1/Th2平衡,從而對AR起到改善作用。