LncRNA NEAT1作為ceRNA解除miR-205-5p對E2F1的靶向作用

錢慶增 吳于婷 王云宇 黃仕藝 孟春燕 裴盛斐 王雪 曹向可 馮福民 王彬

眾所周知,塵肺是最為常見的職業病之一,其占比最大。諸多研究表明[1,2],在發病過程中,巨噬細胞發揮著重要作用,而巨噬細胞會受到多種轉錄因子的調控,且轉錄因子也會受相關mRNA因子的調控。E2F1作為轉錄因子,可直接參與細胞周期的調控[3,4]。并有報道顯示[5],E2F1在細胞周期調控中,可促進G1期向S期的轉變。越來越多的證據表明,miRNA能夠結合轉錄因子,實現基因表達的調控作用,繼而影響細胞的生物學功能,并在多種疾病中發揮著作用[6]。據報道,miR-205高表達,可改善肺纖維化[7]。而LncRNA NEAT1發揮了何種作用,筆者目前未見相關文獻,因而開展此次研究,以探討LncRNA NEAT1對miR-205-5p和E2F1的調控作用,報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑 LncRNA探針(上海艾博思生物科技有限公司),MH-S細胞(上海信裕生物科技有限公司),PBS(北京沃凱生物科技有限公司),轉染質粒[李記生物科技(上海)有限公司],RIP試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司],RIPA裂解液[賽默飛世爾科技(中國)有限公司],Fast SYBR Green PCR試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司],PrimeScript RT reagent 試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司],SinotechTM組織凍存保護液(上海鯨舟基因科技有限公司),水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司),異丙醇(廣州市鴻洲實驗器材科技有限公司),EP管(上海聚慕醫療器械有限公司),PBS(北京沃凱生物科技有限公司),生理鹽水(昆明南疆制藥有限公司),無酶槍頭(美國生物技術公司),異氟烷(瑞沃德生命科技有限公司),注射器(上海聚慕醫療器械有限公司),脫脂奶粉[赫澎(上海)生物科技有限公司],苯甲基磺酰氟(江西江藍純生物試劑有限公司),Trizol [賽默飛世爾科技(中國)有限公司],氯仿(上海吉至生化科技有限公司),蛋白酶K[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]。

1.2 儀器 細胞過濾器(美國生物技術公司),移液器(德國Eppendorf公司),磁力架(深圳市博爾熙科技發展有限公司),生物安全柜(美國熱電生物技術公司),恒溫混勻儀(杭州奧盛儀器有限公司),高壓滅菌鍋(上海博迅實業有限公司醫療設備廠),水平旋轉搖床(無錫杰瑞安儀器設備有限公司),程序降溫盒(上海雷布斯生物科技有限公司),超低溫冰箱[賽默飛世爾科技(中國)有限公司],熒光定量PCR(美國應用生物系統公司),制膠儀(美國Bio-rad公司),CO2培養箱(北京萌壯科技有限公司),杜氏均質器(北京萌壯科技有限公司),制冰機(日本三洋公司),超純水機(密理博中國有限公司),蛋白電泳儀(美國Bio-rad公司),電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.3 實驗動物 C57BL/6小鼠,雄性,6周齡,購買于北京華阜康生物科技股份有限公司,動物許可證編號為:SCXK(京)2018-0003,倫理審批號:LX2018128。建立矽肺小鼠24只,對照小鼠模型6只,取矽肺小鼠18只,分3組,每組6只,分別給予尾靜脈注射小鼠模型(siCtrl、silncRNA NEAT1、silncRNA NEAT1+miR-205-5p抑制劑),用量100 μl,干擾72 h后,異氟烷麻醉,處死小鼠。

1.4 取肺操作 向小鼠腹腔注射5%水合氯醛注射液2 ml,以麻醉;用鑷子從小鼠眼球取血,收集于EP管中;待小鼠休克后,用手術剪從腹部底端,剪“V”字切口,向上剪開,剝離組織,暴露肺,將其剪出,并稱重;取小鼠右肺組織50～100 mg,加入EP管;用移液器加入SinotechTM組織凍存保護液1 ml;程序降溫盒加入異丙醇250 ml,再將裝有組織的EP管置入;擰緊蓋子,放入超低溫冰箱中待測。

1.5 RNA pull-down檢測lncRNA NEAT1與miR-205-5p的相互作用 收集細胞后,用1×PBS漂洗2次,加細胞裂解液200 μl至離心管,以裂解細胞;在冰上孵育10 min,而后轉移細胞至杜氏均質器;經18次均質后,再用臺盼藍染色法檢測細胞膜破損率;當細胞膜破損率≥95%時,4℃,12 000 r/min離心3 min,取上清;將預平衡的Protein A/G Sepharose beads與抗體混勻,旋轉混勻6 h;加beads-抗體混合液,再旋轉混勻6 h;1 000 r/min離心10 s,去上清;用預冷的低鹽漂洗液沖洗beads 2次,冰上進行;再用預冷的高鹽漂洗液沖洗beads 2次,冰上進行;用Proteinase K溶液重懸beads,55℃,消化10 min;用Trizol法提RNA,qRT-PCR檢測RNA的轉錄水平。

1.6 RIP檢測lncRNA NEAT1與miR-205-5p的結合 收集細胞后,加RIPA裂解液,冰浴5 min,以裂解細胞;4℃,2 000 r/min離心5 min,取上清;細胞提取液一部分用作Input,一部分與抗體孵育進行共沉淀;清洗磁珠-抗體復合物,加入RIP Wash Buffer 900 μl,然后重懸;加細胞提取液100 μl至離心管,4℃孵育過夜;收集磁珠-蛋白復合物;用蛋白酶K消化樣品和Input,再用Trizol法提RNA,qRT-PCR檢測RNA的轉錄水平。

1.7 qRT-PCR檢測 1×PBS沖洗培養基后;加Trizol 1 ml,反復吹打,直至完全裂解;靜置5 min;加氯仿0.2 ml,劇烈震蕩15 s后,靜置3 min;4℃,12 000 r/min離心15 min,取上層水相300 μl;再加異丙醇500 μl,顛倒混勻,靜置10 min;4℃,12 000 r/min離心15 min,去上清;而后加75%乙醇(DEPC處理水配制)1 ml,洗滌沉淀;4℃,800 r/min離心5 min,去上清;經干燥5 min,用DEPC處理水20 μl溶解沉淀。取1 μl測量總RNA,將DEPC處理水作空白對照,分別讀取260 nm與280 nm波長下光密度值,確認A260/A280>1.5可用;按照PrimeScript RT reagent Kit說明書將RNA反轉錄cDNA,引物設計。對合成的cDNA用Fast SYBR Green PCR試劑盒與熒光定量PCR儀進行qRT-PCR檢測mRNA,以GADPH作內參,采用2-ΔΔCt法分析相對表達量。見表1。

表1 引物設計

1.8 WB檢測 RIPA裂解液添加終濃度為1 mmol/L的苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解;用Bio-Rad DC Protein Assay試劑盒進行蛋白定量;制備分離膠和濃縮膠;向凝膠泳道內加入樣品18 μl、Marker 4 μl;調節濃縮膠電壓120 V,時間30 min;分離膠電壓100 V,時間90 min;而后轉印,電流200 mA,時間120 min;1×TBST洗膜;浸入含5%脫脂奶粉的1×TBST中,輕搖3 h;加入兔抗鼠E2F1(1∶1 000),4℃孵育過夜;次日復溫30 min,1×TBST沖洗;加山羊抗兔IgG(1∶5 000),搖床孵育2 h;1×TBST洗膜;ECL顯影。

2 結果

2.1 明確轉錄因子E2F1與miR-205-5p的關系 利用生物信息學技術,在starBase、targetScan和miRDB數據庫中,對潛在調控E2F1的microRNAs進行篩選,發現E2F1可能是miR-205-5p的潛在靶基因。見圖1。

圖1 調控E2F1的潛在靶基因篩選

2.2 E2F1潛在靶基因的定量分析 對矽肺小鼠和對照小鼠分別進行miRNAs(miR-17-5p、miR-20-5p、miR-93-5p、miR-106-5p、miR-205-5p、miR-519-3p)的定量分析,結果顯示,只有miR-205-5p在矽肺小鼠肺組織中表達顯著下調(P<0.01),其他miRNAs均無明顯變化(P>0.05),說明miR-205-5p對E2F1存在調控作用。見表2。

表2 E2F1潛在靶基因的定量分析 n=6,

2.3 MH-S細胞轉染silncRNA NEAT1與miR-205-5p抑制劑后E2F1的表達 在MH-S細胞中,分別轉染siCtrl、silncRNA NEAT1、silncRNA NEAT1+miR-205-5p抑制劑,qRT-PCR檢測E2F1的mRNA轉錄水平,WB檢測E2F1的蛋白水平。結果顯示,與siCtrl組相比,轉染silncRNA NEAT1后E2F1表達下調(P<0.05),可見lncRNA NEAT1對E2F1可能存在正向具有調控作用;與silncRNA NEAT1組相比,轉染silncRNA NEAT1+miR-205-5p抑制劑后E2F1表達上調(P<0.01),說明E2F1同時受lncRNA NEAT1與miR-205-5p的調控,且miR-205-5p為負向調控作用。見表3,圖2。

圖2 MH-S細胞轉染干擾質粒后E2F1的蛋白水平(n=6)

表3 MH-S細胞轉染干擾質粒后E2F1的mRNA轉錄水平 n=6,

2.4 RIP檢測lncRNA NEAT1與miR-205-5p的結合 AGO2可通過介導miR-205-5p而發揮作用,而抗AGO2抗體可以將lncRNA NEAT1沉淀下來,表明lncRNA NEAT1可以與AGO2形成復合物,其結合能力不弱于miR-205-5p,說明lncRNA NEAT1與AGO2形成復合物可競爭性結合miR-205-5p。見表4。

表4 RIP實驗檢測lncRNA NEAT1與miR-205-5p的結合 n=6,

2.5 RNA pull-down檢測lncRNA NEAT1與miR-205-5p的相互作用 利用RNA pull-down檢測lncRNA NEAT1與miR-205-5p的結合,將細胞裂解物與生物素標記的NEAT1,NEAT1-Mut(基因突變型),NEAT1-NC(陰性對照)混合,在下拉后,提取microRNA并通過qRT-PCR評估,結果顯示,與NEAT1-Mut組、NEAT1-NC組相比,NEAT1處理后miR-205-5p顯著增加(P<0.05)。見表5。

表5 RNA pull-down檢測lncRNA NEAT1與miR-205-5p的相互作用 n=6,

2.6 動物模型試驗 與siCtrl組相比,轉染silncRNA NEAT1后E2F1表達下調(P<0.01),驗證了lncRNA NEAT1對E2F1有正向調控作用;與silncRNA NEAT1組相比,轉染silncRNA NEAT1+miR-205-5p抑制劑后E2F1表達上調(P<0.01),也驗證了miR-205-5p對E2F1有負向調控作用,lncRNA NEAT1與miR-205-5p同時對E2F1發揮調控作用。與細胞實驗趨勢相同。見表6,圖3。

圖3 小鼠轉染干擾質粒后E2F1的蛋白水平

表6 小鼠轉染干擾質粒后E2F1的mRNA轉錄水平 n=6,

3 討論

矽肺是一種不可逆的慢性職業病,由二氧化硅(SiO2)粉塵所致。在矽肺發病早期,肺部會出現不同程度的炎癥反應,隨著病變進展,會逐漸出現矽結節和漸進性肺間質纖維化。目前,矽肺暫時沒有早期診斷的特異性指標,也沒有特效的治愈手段,所以,探究矽肺發病機制并探索出安全有效的防治纖維化疾病的方法十分迫切。

由于自噬與纖維化疾病密切相關,矽肺中自噬會被激活,對肺纖維化具有一定的保護作用,這就說明在矽肺進展中存在自噬現象。而巨噬細胞是與二氧化硅發生直接關系和主要作用的細胞,其在矽肺中作用巨大。所以,探究巨噬細胞自噬在矽肺纖維化中的作用是必要的。轉錄因子在巨噬細胞自噬進程中發揮著重要的調控作用。有報道顯示,E2F1在肺動脈內皮細胞凋亡中發揮轉錄激活作用[8,9],測序分析發現E2F1與特發性肺纖維化存在一定關聯[10]。而E2F1作為轉錄因子,在矽肺纖維化中仍可發揮作用,但具體作用機制尚未完全清晰。有大量研究表明,E2F1下調可導致高水平的自噬,并參與自噬基因轉錄的調控[11,12]。例如,氨基酸缺乏可誘導自噬,通過減少E2F1和E2F4轉錄,能抑制上調DIRAS3[13]。因而探究轉錄因子E2F1的上游通路,具有重要意義。

近年來,miRNA相關通路在矽肺發病中的作用及分子機制開展的研究已有所見,且越來越多的證據表明,miRNA能夠結合轉錄因子,調節基因表達,繼而影響細胞功能,并在多種疾病中發揮作用,諸如:miRNA-29b(miR-29b)被二氧化硅動態下調,而miR-29b給藥能顯著抑制二氧化硅誘導的上皮-間質轉化(EMT),有助于防止肺纖維化,并改善肺功能[14]。也有研究學者發現,靶向E2F1蛋白的miR-205可抑制黑色素瘤細胞增殖并誘導衰老[15]或提高膠質瘤細胞順鉑敏感性[16]。miR-205-5p和miR-342-3p協同抑制轉錄因子E2F1,可降低抗癌化療耐藥[17]。為了確定miR-205-5p是否對E2F1具有調控,本研究利用生物信息學技術,在starBase數據庫、targetScan數據庫和miRDB數據庫中對潛在調控E2F1的microRNAs(miRs)進行篩選,發現E2F1可能是miR-205-5p的潛在靶基因。

筆者發現,近年來如何調控miR-205-5p和E2F1的關系,成了研究重點。而lncRNA相關通路在矽肺發病中的作用及分子機制也備受關注,lncRNAs不僅在轉錄過程中發揮了調控,還參與了轉錄后調控,具有多種生物學功能。據報道,miR-495-3p和miR-211都受到NEAT1的影響,可能通過調節STAT3和PI3K/AKT信號分別影響細胞的炎癥反應[18]。miR-361直接靶向HSP90以抑制侵襲和EMT特征,NEAT1作為一種致癌lncRNA,可直接抑制miR-361的表達,并在宮頸癌細胞侵襲和球體形成中發揮致癌作用[19]。如果敲除lncRNA NEAT1,有可能造成巨噬細胞M2發生極化反應,對炎性反應具有減弱效應[20]。炎性反應減輕后,自噬表達水平會有所降低,纖維化進程也會減緩,從而發揮調控作用。

本研究發現,與siCtrl組相比,轉染silncRNA NEAT1后E2F1表達下調;與silncRNA NEAT1組相比,轉染silncRNA NEAT1+miR-205-5p抑制劑后E2F1表達上調。說明lncRNA NEAT1下調,會造成E2F1表達下調;而同時抑制miR-205-5p表達,可造成E2F1表達上調,提示lncRNA NEAT1和miR-205-5p表達均會對E2F1產生影響,二者可能為競爭關系,發揮拮抗作用。當沉默lncRNA NEAT1后,miR-205-5p可能會對E2F1產生抑制作用,而同時抑制miR-205-5p能夠進一步促進E2F1表達。提示miR-205-5p對E2F1具有明顯的調控作用功能。

AGO2可通過介導miR-205-5p而發揮作用,而抗AGO2抗體可沉淀lncRNA NEAT1,表明lncRNA NEAT1可以與AGO2形成復合物,其結合能力不弱于miR-205-5p,說明lncRNA NEAT1與AGO2形成復合物可競爭性結合miR-205-5p。與NEAT1-Mut(基因突變型)、NEAT1-NC(陰性對照)相比,NEAT1處理后miR-205-5p顯著增加,而NEAT1-Mut組發生了突變,使得NEAT1調控miR-205-5p的作用降低,進一步證明NEAT1對miR-205-5p的競爭性抑制作用,有助于解除miR-205-5p對E2F1的靶向作用。提示lncRNA NEAT1/miR-205-5p/E2F1通路是存在的。

綜上所述,LncRNA NEAT1可作為ceRNA,解除miR-205-5p對E2F1的靶向作用。該研究整體分析了lncRNA NEAT1、miR-205-5p、E2F1的相互關系,為后續研究提供了科學依據。通過明確lncRNA NEAT1、miR-205-5p、E2F1的生物學功能,旨在為防治相關疾病提供一種新思路。但在lncRNAs與矽肺纖維化的機制研究中,要從多角度、多層面開展分析,將有助于揭示矽肺纖維化的發病機制。外界致矽肺纖維化因素的刺激、肺效應分子、多個信號通路及效應蛋白的參與,使得lncRNAs調控矽肺纖維化的機制變得非常復雜,形成了細胞-分子-通路-蛋白網絡。要明確lncRNAs 在矽肺纖維化中的作用,還有很長的路要走,很多機制還需要深入研究。