參附注射液對廣西巴馬小型豬離體空跳心臟心肌保護的研究

劉豫 高春雁 武偉 覃冠斌 羅蘭 馮志強 銀世杰

供體心臟保存的臨床標準是靜態冷藏[1],這使器官處于冷缺血狀態,從而限制安全保存間隔(4～6 h),并增加原發性移植物功能障礙的風險[2]。體外心臟灌注(ESHP)是一種新的體外器官灌注技術,通過在保存期間向心臟提供含氧、營養豐富的灌注液,最大限度減少對冷缺血的暴露。ESHP已被證明在保存標準供體心臟方面不劣于冷藏[1],并促進了循環死亡后捐贈心臟的臨床移植[3,4]。然而,在離體心臟灌注期間,炎性反應不可避免,其機制與血液接觸非生物材料激活接觸系統和補體系統等因素有關[5]。細胞因子被認為是體外循環全身炎性反應的重要介質[6]。細胞因子的釋放會誘導細胞因子的產生和再釋放,進而加劇細胞和器官的損傷[7],造成心肌功能障礙,降低供心保存的質量。參附注射液是由紅參和黑附片提取而成的中藥制劑,主要活性成分為人參皂苷Rg1等皂苷類成分和烏頭堿等生物堿類成分,這類成分具有較好的藥理活性[8]。參附注射液因其多成分多靶點的優點,在臨床上被廣泛應用在心血管疾病中[9]。參附注射液可以顯著降低慢性心力衰竭患者血清中IL-6、TNF-α的水平,延緩并改善心室重構,有效提高患者心功能[10]。趙雅彬等[11]發現參附注射液可減少急性ST段抬高型心肌梗死并發心源性休克患者血清中IL-6和hs-CRP的濃度,改善患者預后。此外還有研究表明,參附注射液可降低膿毒癥大鼠血清和腎臟組織中IL-6的水平,發揮對腎臟的保護作用[12]。目前有關參附注射液對離體空跳心臟心肌保護作用的研究筆者所見報道甚少,尋求一種高質量供心保存方法又迫在眉睫。故我們假設參附注射液可通過抑制體外循環過程中的炎性反應發揮心肌保護作用,以期提供一種新的高質量供心保存策略。

1 材料與方法

1.1 動物 Sprague-Dawley(SD)小型豬,購自廣西大學動物實驗中心,實驗動物許可證號:SCXK桂2018-0003。

1.2 藥物與試劑 參附注射液(雅安三九藥業有限公司,批號:210310AK070),心臟停跳液(法蘭滋克勒博士化學有限公司,批號:2222811),乳酸脫氫酶試劑盒(廣西康柏萊科技有限公司,批號:22040101),α-羥丁酸脫氫酶試劑盒(美康生物科技股份有限公司,批號:202210102),肌酸激酶同工酶試劑盒(美康生物科技股份有限公司,批號:220308102)鈣離子試劑盒(美康生物科技股份有限公司,批號:220412101),TNF-αELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司,批號:JM-01217P1),IL-6 ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司,批號:JM-01252P1),IL-8 ELISA試劑盒(江蘇晶美生物科技有限公司,批號:JM-01251P1)。

1.3 儀器與設備 體外循環機,變溫水箱,人工新心肺機體外循環管道,膜式氧合器,壓力傳感器,全自動生化儀(Abbott Laboratories,設備編號:GYZ-LAB-SH-003),酶標儀。

1.4 方法

1.4.1 實驗動物 選擇12頭體重為25～30 kg的健康成年廣西巴馬小型豬(廣西大學提供),按照隨機數字表法分為參附注射液組和0.9%氯化鈉溶液組,每組6頭。術前禁食12 h,術前禁飲6 h,于臀部肌內注射咪達唑侖5 mg、阿托品0.5 mg,待實驗豬安靜后,用24G靜脈留置針在耳緣靜脈建立靜脈通道并固定于實驗臺,依次靜脈推注咪達唑侖0.1～0.15 mg/kg、舒芬太尼0.2 μg/kg、丙泊酚2.5 mg/kg和羅庫溴銨0.6 mg/kg,行氣管插管并與連接氧袋的呼吸球囊連接,潮氣量為10 ml/kg,吸氣/呼氣比為1∶2。麻醉維持:采用靜脈泵入丙泊酚4～12 mg·kg-1·h-1。

1.4.2 供體心臟準備:實驗豬在全麻下,取胸部正中切口暴露胸腔,全身肝素化后,游離前腔靜脈和后腔靜脈,剪開心包,在升主動脈靠近無名動脈處插入灌注針并固定,連接采血袋放血600 ml。結扎前靜脈和后腔靜脈,阻斷主動脈并灌注心肌保護液使心臟停跳,迅速切斷下腔靜脈和切開右肺靜脈進行減壓,剪斷左肺靜脈、主動脈和肺動脈取出完整心臟并放入冰0.9%氯化鈉溶液中。

1.4.3 離體空跳心臟模型制備:先在膜肺中加入鈉鉀鎂鈣葡萄糖注射液、羥乙基淀粉、甲強龍、氨甲環酸、葡萄糖酸鈣、5%碳酸氫鈉、頭孢進行預充,參附注射液組在此基礎上加10 ml參附注射液預充;并將采集好的豬血600 ml經白細胞過濾器過濾后注入膜肺中與其他預充液混合以進行充氧和溫度變化。95%氧氣和5%二氧化碳對灌注回路中的血液進行氧合,水箱溫度調至35℃。供心取下后,用0.9%氯化鈉溶液沖洗心臟中殘存的停跳液,立即與體外循環機連接進行血液灌注,心臟停搏至心臟進行血液灌注的時間控制在10 min內。供心持續灌注8 h,壓力控制在40～60 mm Hg。在灌注過程中,參附組連續輸注5 ml/h的參附注射液,0.9%氯化鈉溶液組則輸入等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 觀察指標

1.5.1 心肌損傷指標:在建立體外循環開始(T0)、建立循環第1個小時(T1)、第2個小時(T2)、第3個小時(T3)、第4個小時(T4)、第5個小時(T5)、第6個小時(T6)、第7個小時(T7)、第8個小時(T8)9個時間點取血5 ml,3 000 r/min 離心10 min后取上清液,CKMB采用免疫抑制法、LDH采用IFCC推薦法、α-HBDH采用DGKC推薦法,評估心肌損傷情況。

1.5.2 ELISA檢測:TNF-α、IL-6、IL-8 在建立體外循環開始(T0)、建立循環第1個小時(T1)、第2個小時(T2)、第3個小時(T3)、第4個小時(T4)、第5個小時(T5)、第6個小時(T6)、第7個小時(T7)、第8個小時(T8)9個時間點取血2 ml,3 000 r/min 離心20 min后取上清液。在酶標板上設置標準品和孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50 μl;分別設置空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑,其余各步驟相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μl,然后再加待測樣品10 μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板底部,盡量不觸及孔壁,然后輕輕晃動混勻。每孔加入酶標試劑100 μl,空白孔除外。用封板膜封板后置37℃溫育60 min,同時將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。孵育完,小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置30 s后棄去,如此重復5次,拍干。每孔再加入顯色劑A 50 μl,顯色劑B 50 μl,輕輕震蕩混勻,37℃避光顯色15 min。顯色完成后每孔加入終止液50 μl終止反應。放入酶標儀后450 nm波長依次測量各孔吸光度(OD)值,以空白孔調零,根據標準品濃度和OD值繪制出標準曲線,再將樣本OD值代入計算,所得濃度乘以5為最終濃度。

1.5.3 血流動力學檢測:在建立體外循環開始(T0)、建立循環第1個小時(T1)、第2個小時(T2)、第3個小時(T3)、第4個小時(T4)、第5個小時(T5)、第6個小時(T6)、第7個小時(T7)、第8個小時(T8)9個時間點用秒表記錄心率、壓力傳感器的灌注壓以及體外循環機的每分鐘流量。

1.5.4 心肌超微結構檢測:在常溫離體灌注的第8個小時待心臟停搏后,取左心室壁體積不超過1 mm×1 mm×1 mm的心肌組織,迅速投入電鏡固定液4℃固定2 h。0.1 mol/L磷酸緩沖液PB(pH值 7.4)漂洗3次,15 min/次;再用1%的鋨酸·0.1 mol/L磷酸緩沖液PB室溫后固定2 h,0.1 mol/L磷酸緩沖液PB,漂洗3次,15 min/次。用酒精對組織進行梯度脫水,丙酮滲透后包埋切片,鈾鉛雙染色(2%醋酸鈾飽和酒精溶液,枸櫞酸鉛,各染色15 min),切片室溫干燥過夜后透射電子顯微鏡下觀察。

2 結果

2.1 2組離體心臟灌注模型心肌損傷標志物比較 血清中CKMB、α-HBDH、LDH的水平隨著時間變化顯著增加(P<0.05);與0.9%氯化鈉溶液組比較,參附注射液組在連續灌注的過程中血清中CKMB(F=5.312,P=0.044)、α-HBDH(F=5.973,P=0.035)、LDH(F=5.747,P=0.037)的含量明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組離體心臟灌注模型不同時間點心肌損傷標志物的變化 n=6,

2.2 2組離體心臟灌注模型促炎細胞因子比較 血清中TNF-α、IL-6、IL-8的濃度隨著時間變顯著增加(P<0.01);與參附注射液組比較,0.9%氯化鈉溶液組中TNF-α、IL-6、IL-8的含量明顯增加,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組離體心臟灌注模型不同時間點促炎細胞因子的變化 n=6,

2.3 2組離體心臟灌注模型血流動力學比較 2組間心率、灌注壓、每分鐘流量差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 2組離體心臟灌注模型血流動力學比較 n=6,

2.4 2組離體心臟灌注模型左心室心肌組織超微結構比較 0.9%氯化鈉溶液組心肌細胞中度退行性變,細胞結構損傷相對明顯,線粒體增生,數量明顯增多,大量聚集肌纖維間,輕度腫脹,膜完整,膜內基質局部變淡,嵴斷裂、減少。肌纖維融合、變粗。肌原纖維絲結構致密,肌節呈非對稱性分布,大面積收縮帶形成,Z線排列紊亂、數量減少, H帶大面積消失。參附注射液組肌纖維排列較整齊、緊密,未見明顯斷裂,胞質未見水腫,細胞器結構尚可,線粒體呈卵圓形,分布較均勻,大多結構正常,基質均勻,嵴平行排列,膜完整,未見明顯增生,均勻分布肌纖維間,Z線排列較整齊,連續, H帶結構存在,清晰,損傷程度較0.9%氯化鈉溶液組更輕。見圖1。

0.9%氯化鈉溶液組 參附注射液組

3 討論

心臟移植是符合條件的晚期心力衰竭患者的“金標準”治療[13],但其使用仍受到器官可用性的限制。目前的臨床移植心臟保存技術包括通過冠狀動脈輸注低溫高鉀停搏液快速冷卻心肌,然后將心臟浸入4℃的等滲鹽水浴中[14]。然而該技術受到4～6 h的安全組織保存時間的限制。ESHP是傳統靜態冷藏的一種替代策略,在移植前保存和評估供體心臟已引起越來越多的臨床興趣。有研究表明,與紅細胞濃縮物(RBC,n1/46)、無細胞血紅蛋白基氧載體(HBOC,n1/48)等灌注液相比,基于全血的灌注液可以更好地保護心肌功能[15]。離體空跳心臟模型是體外心臟灌注的一種模式,通過用氧合的溫全血以及特定成分的灌注液灌注心臟,建立體外循環[16]。

然而,體外循環誘發的炎性反應是供體心臟保存面臨的一大挑戰。其機制包括補體活化、細胞因子釋放、自由氧自由基產生、花生四烯酸代謝產物、血小板活化因子、一氧化氮和內皮素過表達[17]。此外,CPB回路中血液-空氣界面也會驅動炎性反應[18]。其中,細胞因子的釋放觸發的細胞因子風暴是導致心肌功能障礙的一個重要危險因素。細胞因子引發的壓倒性炎性反應可能會導致各種器官功能受損,因此理論上治療這種現象的方法有可能減輕器官功能受損。

參附注射液由紅參和附子兩種中藥組成,人參皂苷和烏頭堿是其主要有效成分,其作用機制有改善大循環和微循環、清除氧自由基、提高超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性減輕氧化應激反應、提高內質網鈣離子ATP酶活性以及降低L型鈣通道開放率減輕心肌細胞內鈣離子超載等發揮心肌保護作用[19,20];參附注射液還可通過降低血清中TNF-α、IL-6、IL-8的水平減輕炎性反應對細胞的損傷[21],因此被廣泛用于心血管疾病的治療。本實驗在心臟開始灌注之前加入參附注射液于灌注液中進行預處理,并在心臟連續灌注的8 h中持續往膜肺中泵入參附注射液,從抑制促炎細胞因子的角度剖析參附注射液對心肌的保護作用。本研究結果表明,心臟在體外連續灌注的過程中,血清中TNF-α、IL-6、IL-8的水平隨著時間變化顯著增加,且參附注射液可以顯著抑制TNF-α、IL-6、IL-8的表達,結果與文獻中報道[22,23]一致。CKMB、LDH、α-HBDH在靜息狀態下主要存在于心肌細胞內,當心肌細胞受到損傷時,這些酶從細胞中釋放入血,造成血液中的濃度升高。本實驗結果還表明CKMB、LDH、α-HBDH的濃度與時間呈顯著相關,參附注射液可降低血清中CKMB,LDH,α-HBDH的水平,差異有統計學意義(P<0.05),王振富[24]也得出了相同的結論。

綜上所述,參附注射液通過降低血清中TNF-α、IL-6、IL-8促炎細胞因子的水平,減少了細胞因子對心肌細胞和組織的損傷,故血清中CKMB、LDH、α-HBDH的濃度明顯降低,對離體空跳心臟心肌細胞發揮了保護作用。