非結核分枝桿菌感染者肝腎功能、免疫功能和耐藥性分析

萬鑫蕊，王曉燕，王 霖，馬志強，李才信，許世濤，唐興蕊，毛紅艷

（昆明市第三人民醫(yī)院檢驗科/云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學中心，云南 昆明 650301）

非結核分枝桿菌（non tuberculous mycobacterum，NTM）是指除麻風分枝桿菌和結核分枝桿菌復合群（tuberculosis，TB）以外的分枝桿菌，目前已超過170 種非結核分枝桿菌菌種被報道。NTM 在水、土壤等自然環(huán)境中廣泛存在，可引起肺、皮膚、淋巴結和軟組織等感染，其中NTM 肺病占90%以上[1]。隨著免疫抑制人群的增多和細菌分離鑒定技術的提高，我國NTM 感染率呈逐年增加的趨勢，已逐漸成為公共衛(wèi)生健康問題。NTM 感染與結核病的臨床表現(xiàn)、實驗室和影像學檢查十分相似，常常被誤診為肺結核。因此NTM 感染者大多接受了無效的抗結核治療，引起了由抗結核藥物導致的肝、腎功能損傷[2]。除此之外，目前研究表明機體免疫狀態(tài)與NTM 感染和發(fā)展密切相關，尤其CD4+T 淋巴細胞在分枝桿菌感染的免疫控制中起重要作用[3]。為此分析我院非結核分枝桿菌感染者的肝腎功能、免疫功能和耐藥性，以期為NTM 的臨床診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2021 年5 月至2022 年3 月在昆明市第三人民醫(yī)院確診為非結核分枝桿菌感染的患者122 例為非結核組，其中男性55 例，女性67 例。并隨機選取同期確診為結核分枝桿菌感染的患者共130 例作為結核組，其中男性71 例，女性59 例。同時選取健康體檢者150 例作為健康組，其中男性68 例，女性82 例。根據(jù)年齡段將2 組感染者分為青年（＜ 45 歲）、中年（45～60 歲）、老年（＞ 60 歲）3 組。本研究經(jīng)過昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會審查（KSLL20230320007）。非結核分枝桿菌感染者診斷標準[4]：符合下述條件之一可作出診斷（1）痰2 次NTM 培養(yǎng)均是同一致病菌；（2）痰或支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)陽性++以上1 次；（3）痰或支氣管肺泡灌洗液NTM 培養(yǎng)陽性1 次，涂片抗酸桿菌陽性++以上；（4）經(jīng)支氣管鏡或其他肺組織檢查，表明分枝桿菌組織病理學特征性（肉芽腫性炎或抗酸桿菌陽性），同時NTM 培養(yǎng)陽性；（5）肺組織活檢發(fā)現(xiàn)分枝桿菌組織病理學特征（肉芽腫性炎或抗酸桿菌陽性）且至少1 個痰液或支氣管肺泡灌洗液NTM 培養(yǎng)陽性1 次。結核分枝桿菌感染者診斷標準[5]：（1）2 個痰標本涂片抗酸染色直接顯微鏡鏡檢陽性；（2）1 份痰標本涂片抗酸染色直接顯微鏡鏡檢陽性，同時符合肺部影像學檢查活動性肺結核影像；（3）1 份痰標本涂片抗酸染色直接顯微鏡鏡檢陽性，同時1 份痰標本結核菌培養(yǎng)陽性。排除標準：同時感染非結核和結核分枝桿菌的患者。

1.2 肝、腎功能檢測

采用日立公司生產(chǎn)的008as 全自動生化分析儀檢測結核組、非結核組和健康組的肝、腎功能指標包括總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBLI）、間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、谷氨酰氨基轉移酶（γ-glutamyl transpeptidase，GGT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、肌酐（creatinine，CR）、尿素（carbamide，UREA）和尿酸（uric acid，UA）。

1.3 藥敏實驗

采用銀科公司分枝桿菌藥敏檢測試劑盒進行微孔板藥敏檢測實驗。吸取200 μL 雜菌抑制劑和200 μL 1mg/mL 的菌懸液加入到藥敏培養(yǎng)集基中，混勻后吸取200 μL 加入到微孔藥敏板中。放置于35 ℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 d 后觀察結果。

結核分枝桿菌藥敏包含異煙肼INH、利福平RFP、鏈霉素SM、乙胺丁醇EMB、左氧氟沙星LVFX、利福噴丁RFT、利福布丁RFB、丙硫乙酰胺PTO、力克肺疾DIP、對氨基水楊酸PAS、莫西沙星MFX、氯法齊明CFZ、卡那霉素KM、卷曲霉素CPM、克拉霉素CLR、阿米卡星AMK共16 種；非結核分枝桿菌藥敏包含利福平RFP、乙胺丁醇EMB、阿米卡星AMK、莫西沙星MOX、克拉霉素CLR、利福噴丁RFT、米諾環(huán)素MNO、利奈唑胺LNZ、多西環(huán)素DOX、妥布霉素TOB、亞胺培南/西司IM/CI、加替沙星GAT、磺胺甲唑SMX、頭孢西丁FOX、阿奇霉素AZM、和共15 種。

1.4 淋巴細胞亞群檢測

使用邁瑞公司CD3/CD4/CD8/CD45 檢測試劑對結核組、非結核組和健康組進行外周血T 淋巴細胞亞群計數(shù)。取CD3/CD4/CD8 檢測試劑20 μL，加入EDTA 抗凝外周靜脈血50 μL，渦旋混勻后室溫避光放置15 min 后加入450 μL 溶血劑，渦旋混勻后室溫避光放置15 min 后通過流式細胞儀檢測各組 CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細胞數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用Excel 2013 建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 23.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料用（）表示，非正態(tài)分布的計量資料用M（P25，P75）表示。組間比較采用非參數(shù)秩和檢驗。計數(shù)資料用n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 一般資料比較

非結核分枝桿菌感染者122 例，其中男性55 例、女 性67 例，年 齡15～87 歲，平 均（48.75±16.60）歲；結核分枝桿菌感染者130 例，其中男性71 例、女性59 例，年齡17～83 歲，平均（42±17.94）歲；健康對照組150 例，其中男性68 例、女 性82 例，年 齡16～85 歲，平 均（44±15.87）歲。非結核分枝桿菌感染者青年45 例、中年49 例、老年28 例；結核分枝桿菌感染者青年56 例、中年44 例、老年20 例；健康對照組青年79 例、中年45 例、老年26 例。3 組在不同年齡組和性別間的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 非結核和結核分枝桿菌感染者年齡、性別比較[n（%）]Tab.1 Comparison of age and sex between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected people[n（%）]

2.2 肝腎功能指標比較

非結核組與結核組和健康組肝、腎功能指標比較，非結核組TBIL 9.0（6.9，12，6）、ALT 14（11，20）、AST 21（16，27）、GGT 23.6（16.9，41.1）、CR 63（53，73）、UA 375（300，478）與結核組和健康組相比均較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。進一步分析非結核組和結核組2組間肝、腎功能指標差異，非結核組TBIL、ALT、AST、GGT 與結核組相比均較高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 非結核和結核分支桿菌感染者肝腎功能指標比較[M（P25，P75）]Tab.3 Comparison of liver and kidney function indexes between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients [M（P25，P75）]

2.3 外周血T 淋巴細胞亞群比較

非結核組和結核組的CD3+T、CD4+T、CD8+T與健康組相比均較低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。非結核組CD8+T 淋巴細胞計數(shù)高于結核組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），CD3+T 和CD4+T與結核組相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05）。3 組間CD4/CD8 差異無統(tǒng)計學意義（P＞ 0.05），見表4和圖1。

圖1 非結核和結核分支桿菌感染患者免疫功能比較Fig.1 Comparison of immune function between nontuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients.

表4 非結核和結核分支桿菌感染患者免疫功能比較（）Tab.4 Comparison of immune function between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients（）

表4 非結核和結核分支桿菌感染患者免疫功能比較（）Tab.4 Comparison of immune function between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients（）

3組間差異的顯著性用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗，*P＜0.05。3組間兩兩比較采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗，與健康組比較#P＜0.05；與結核比較，ΔP＜0.05。

2.4 耐藥性情況比較

結核組對異煙肼的耐藥率最高為22.31%，其次為利福平和利福噴丁分別為17.69%和16.15%。而對于丙硫乙酰胺、氯法齊明、卡那霉素、卷曲霉素、克拉霉素和阿米卡星均未有耐藥菌株檢出。在非結核組中，亞胺/西司的耐藥率最高為99.18%，其次為多西環(huán)素和米諾環(huán)素，分別為78.69%和72.95%。非結核組對利福平、乙胺丁醇、阿米卡星、克拉霉素和利福噴丁的耐藥率均高于結核組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表5、表6。

表5 非結核和結核分支桿菌感染患者耐藥性比較（n）Tab.5 Comparison of drug resistance between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients（n）

表6 非結核和結核分枝桿菌感染患者對同種抗結核藥物耐藥性比較n（%）Tab.6 Comparison of drug resistance with the same anti-tuberculosis drugs between non-tuberculosis and mycobacterium tuberculosis infected patients n（%）

3 討論

NTM 多發(fā)生于存在慢性基礎肺部疾病和免疫功能缺陷的人群[6]。近年來NTM 感染導致的疾病發(fā)病率逐年上升，而NTM 感染和TB 感染臨床癥狀相似，使之前部分診斷為肺結核的患者實際為NTM 感染。隨著NTM 檢測技術的發(fā)展，NTM 檢出率也呈逐年上升的趨勢，成為了值得研究的重要公共健康問題。

有研究表明，與青年相比中老年人感染NTM較為常見，可能與NTM 自身的生物學特性有關。NTM 是機會致病菌，與結核分枝桿菌相比毒力較弱，因此免疫力低下的中老年人更容易感染[7]。但在本研究中，非結核組和結核組相比年齡和性別沒有顯著差異。排除了后續(xù)對兩組臨床特征分析時年齡和性別帶來的干擾。

目前使用的大部分抗結核藥物對肝功能和腎功能均有一定的損害，并且多種抗結核藥物聯(lián)合用藥與藥物性肝損傷的發(fā)生密切相關[8-9]。異煙肼、利福平、乙胺丁醇等一線抗結核藥物均會對患者的肝、腎功能產(chǎn)生影響，包括膽紅素代謝異常、膽汁淤積以及腎臟代謝功能異常等[10]。本研究中與結核組和健康對照相比NTM 感染者肝腎功能指標均有不同程度的升高，而TB 感染者肝腎功能指標變化相對較少。NTM 感染組肝功能指標如TBIL、ALT、AST、GGT 均高于TB 感染組。提示NTM 組肝功能損傷更加嚴重，可能與非結核分枝桿菌感染易誤診為肺結核有關。非結核分枝桿菌感染后的臨床癥狀和結核分枝桿菌相似，均有發(fā)熱、咯血、咳嗽和咳痰等癥狀。并且NTM 感染也可使結核菌素實驗、結核菌感染T 淋巴細胞斑點實驗表現(xiàn)為陽性，因此NTM 感染易被誤診為結核分枝桿菌感染和結核病[11]，且大多NTM 感染者按照抗結核方案進行治療，不僅治療效果不佳而且容易導致耐藥菌株的產(chǎn)生。長期抗結核藥物的使用也使NTM 感染者與TB 感染者相比藥物性肝損傷更加嚴重。

在復雜的宿主-病原體相互作用過程中，NTM 感染者的免疫功能受到抑制。固有免疫和適應性免疫在對抗NTM 感染均起到重要作用。NK細胞和巨噬細胞可以在感染早期階段通過吞噬作用和顆粒酶消除和殺滅非結核分枝桿菌[12]。此外，CD4+T 和CD8+T 淋巴細胞介導的細胞免疫促進各種細胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，起到預防和控制NTM 感染作用[13]。本研究中，與健康對照組相比NTM 感染者和TB 感染者的CD3+T、CD4+T 和CD8+T 計數(shù)均有降低，提示2 組免疫功能均有一定損傷和降低，使感染者無法產(chǎn)生針對NTM 侵襲的細胞因子和抗體，最終促使NTM-PD 的發(fā)生。NTM 感染組CD8+T 淋巴細胞與結核分枝桿菌感染組相比顯著升高，CD3+T、CD4+T 和CD4/CD8 相對較高但差異無統(tǒng)計學意義。CD4+T 釋放的細胞因子如γ-干擾素、IL-12 等可激活巨噬和中性粒細胞殺滅NTM[14]，而CD8+T 淋巴細胞可以抑制體液和細胞免疫反應促使NTM 病情進展[15]。這種淋巴細胞亞群數(shù)量和比例的變化提示了NTM感染者免疫功能的紊亂和受損，也反映出細胞免疫的失衡可能增加了NTM 的易感性[16]。

分析NTM 感染者藥敏結果發(fā)現(xiàn)，亞胺/西司、多西環(huán)素、米諾環(huán)素、乙胺丁醇和磺胺甲唑的耐藥率均超過50%，但對阿米卡星和莫西沙星的耐藥率較低，僅為4.1%。對于同種抗結核藥物，如利福平、乙胺丁醇、阿米卡星、克拉霉素和利福噴丁等，非結核分枝桿菌往往具有更高的耐藥率。由于NTM 細胞壁的通透性屏障和表面的高疏水性[17]，NTM 對亞胺/西司、乙胺丁醇和磺胺甲唑基本處于天然耐藥狀態(tài)。除此之外，抗菌藥物的長期使用、頻繁更換也是耐藥基因突變和耐藥菌株大量繁殖的重要原因之一[18]。因此加強分枝桿菌的菌種鑒定，非結核分枝桿菌藥敏試驗的推廣應用，對指導臨床用藥、減少耐藥菌株的產(chǎn)生以及減輕患者痛苦和經(jīng)濟負擔具有重要的意義。