一株腸道分離的噬菌體對臨床金黃色葡萄球菌裂解作用的評價*

李玉憶 高玉錄

南京中醫藥大學附屬昆山市中醫醫院,江蘇省昆山市 215300

金黃色葡萄球菌是臨床常見的重要病原菌之一,尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)。MRSA感染具有難治療和高死亡率的特點,已經給全球醫療機構帶來了沉重的負擔[1]。由于它對最常用抗生素的耐藥性,MRSA感染患者的治療選擇非常有限[2]。近幾十年來還出現了MRSA對萬古霉素以及相對較新的藥物如利奈唑胺和達托霉素的抗性[3],使得治療非常棘手。目前,噬菌體療法是一種治療MRSA極具前景的抗生素替代方案,正以其高效力和高特異性,重新得到人們的關注。而噬菌體治療的成功取決于所分離的噬菌體特性及其與宿主的適應性。本研究旨在評估分離源自病人腸道的噬菌體在治療金黃色葡萄球菌感染中的價值。

1 材料和方法

1.1 細菌菌株及培養條件 本研究采用的1～60號菌為從本院臨床標本中分離并保存的金黃色葡萄球菌菌株,標準菌株ATCC43300為微生物實驗室質控保存的菌株。所有細菌都在血平板上37℃生長。

1.2 噬菌體分離 收集本院金黃色葡萄球菌感染的病人的新鮮糞便5g,加入100ml普通液體培養基內,于37℃溫箱孵育過夜。次日70℃加熱30min后離心15min,上清液通過0.22μm的膜過濾器(Millipore)滅菌。將10ml樣品與指數期宿主細胞(金黃色葡萄球菌ATCC43300)加入10ml胰蛋白酶大豆肉湯(TSB,Sigma)中,在37℃、140r/min條件下孵育過夜。次日將混合液4℃離心15min,上清液通過0.22μm膜過濾器滅菌。將1ml過濾后的有效樣品上清液與宿主細胞和5ml軟瓊脂(Oxoid)充分混合,然后將其覆蓋在胰蛋白酶大豆瓊脂平板上(TSA,Sigma),在37℃孵育過夜。當觀察到清晰的嗜菌斑后,取單個斑塊加入3ml含宿主菌株的TSB中于37℃、140r/min下孵育過夜。重復雙瓊脂層法直到只存在單一的嗜菌斑。分離后的噬菌體于SM緩沖液(Phygene)中4℃保存。

1.3 細菌鑒定和抗菌藥物敏感性分析 采用全自動細菌鑒定和藥敏儀VITEK2 Compact(生物梅里埃)依照設備標準說明書進行。藥敏結果根據美國臨床實驗室標準化協會(Cinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)指南標準判讀。

1.4 噬菌體宿主范圍分析 將0.1ml的過夜細菌培養物(OD600=0.1)加入5ml的軟瓊脂中,然后覆蓋在營養瓊脂平板(Oxoid)上,待凝固后將純化的噬菌體點到每個細菌平板上,37℃孵育過夜后觀察噬菌斑形成情況。

1.5 大蠟螟幼蟲模型 大蠟螟幼蟲(新盛生物技術有限公司)儲存在4℃的黑暗環境中,使用時選擇重量在200～300mg之間的健康幼蟲。取隔夜細菌培養物OD600為0.3,用10μl Hamilton注射器(Fisher Scientific)將5μl稀釋的細菌懸浮液注入每只幼蟲右腿。感染2h后,向治療組的幼蟲對側前腿注射5μl的噬菌體。對照組未予噬菌體治療。注射后的幼蟲在37℃培養皿中培養。每組隨機分配10只幼蟲。另設一個空白組沒有接受任何注射,一個磷酸緩沖鹽溶液(PBS)組只注射PBS以評估與創傷有關的死亡。每24h記錄一次存活率并持續7d,當幼蟲變黑或對觸摸無反應時標記為死亡。進行三個獨立的重復,結果以生存曲線的形式呈現。

1.6 統計學方法 用GraphPad Prism 9.0(GraphPad Software Inc., CA)分析數據。用對數秩檢驗分析大蠟螟蟲的存活率,以P≤0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌藥敏試驗結果 從腸道樣本中成功分離出可裂解標準菌株ATCC43300的噬菌體SY01對于臨床金葡菌具有不同的裂解作用。無嗜菌斑形成(-)的菌株有33.3%(20/60),可見噬菌斑形成的菌株占66.7%(40/60)。其中,根據噬菌斑情況(見圖1)分類,噬菌斑+占21.7%(13/60),噬菌斑++占35%(21/60),噬菌斑+++占10%(6/60),見表1。

(+) (++) (+++)

表1 臨床金黃色葡萄球菌藥敏試驗結果

2.2 金黃色葡萄球菌對多種抗生素耐藥性及噬菌體SY01對MRSA、MSSA的作用 60株臨床金黃色葡萄球菌抗生素耐藥性分析顯示,大多數菌株對所檢測的多種抗生素耐藥。其中對苯唑西林耐藥率78.3%,即MRSA占78.3%(47/60),對甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)占21.7%(13/60),對紅霉素耐藥率為80%(48/60),未檢測到對萬古霉素和利奈唑胺耐藥(0/60),見表1。噬菌體敏感性分析顯示46.2%(6/13)的MSSA和72.3%(34/47)的MRSA對SY01噬菌體敏感,兩者無統計學差異,表明噬菌體SY01具有較寬的裂解宿主范圍,對MRSA和MSSA均有裂解作用。

2.3 噬菌體SY01治療對金黃色葡萄球菌感染大蠟螟幼蟲生存率的影響 感染金黃色葡萄球菌ATCC43300后,對照組的幼蟲在3d內全部死亡。使用噬菌體SY01的治療組在第3天存活率為40%,第7天存活率為10%(P<0.05)。空白組和PBS組的7d存活率分別為100%和90%,兩者無統計學差異(P>0.05),表明注射引起的損傷與幼蟲死亡率無關。

3 討論

本研究從病人腸道分離一株可裂解金黃色葡萄球菌的噬菌體SY01,并通過體外和體內實驗評估了其治療金葡菌感染的潛在應用價值。結果顯示,此次分離的噬菌體SY01可以裂解近2/3臨床金葡菌菌株,表現出較寬的裂解宿主范圍,多重耐藥的臨床菌株對該噬菌體表現出較好的敏感性,MRSA的敏感性高達72.3%。體內實驗顯示,金葡菌感染后的幼蟲經該噬菌體治療7d存活率高于對照組,提示該噬菌體具有抗金黃色葡萄球菌感染的應用前景。

本實驗中有1/3的臨床金黃色葡萄球菌菌株表現出對該噬菌體耐受,表明細菌抵抗噬菌體機制的存在。總體來說噬菌體感染的過程包括五個階段,分別為附著、攝取、生物合成、組裝和裂解[4]。目前關于葡萄球菌的噬菌體抗性研究關注于附著、生物合成和組裝這三個階段:(1)噬菌體感染的首個步驟是噬菌體附著在葡萄球菌細胞的外部。如果細菌表面的受體分子不存在或被阻斷,噬菌體無法識別受體從而影響它的吸附。受體的相關突變可以通過抑制噬菌體吸附而導致噬菌體抗性的產生。分子研究顯示,通過刪除參與壁磷壁酸(WTA)生物合成的第一個基因,十一烯丙基磷酸N-乙酰葡糖胺1-磷酸轉移酶(tagO),金黃色葡萄球菌表面的主要受體發生改變,從而表現出對測試的噬菌體(Φ812和ΦK)的抵抗[5]。(2)其次,在噬菌體的生物合成階段中可能存在抵抗機制。限制性修飾(R-M)系統是金黃色葡萄球菌感染的一個重要障礙,它能通過降解注入的噬菌體DNA來干擾其生物合成[6]。所有四種類型的R-M系統都存在于金黃色葡萄球菌中:Ⅰ型R-M系統是金葡菌中最豐富的R-M系統類型,其次是Ⅳ型和Ⅱ型系統,Ⅲ型系統很罕見[7]。R-M系統是一個模塊化操作子,包含編碼三種功能的宿主特異性決定因素(hsd)的組合[8]。毒素—抗毒素(T-A)系統也通過干擾噬菌體的生物合成在細菌的抗噬菌體過程中起作用。例如Ⅲ型ToxN/Iyizhi對抗噬菌體A2M1[9],Ⅳ型系統AbiE/Id對抗多種噬菌體[10]。本研究組發現金黃色葡萄球菌T-A系統相關位點SAUSA300_2026的突變導致噬菌體敏感性改變,證明了Ⅱ型T-A系統在金黃色葡萄球菌防御噬菌體中的重要作用[11]。此外,另一種細菌的防御方式是簇狀規則間隔短回文重復序列(CRISPRs),它以序列特異性方式裂解外部DNA從而獲得對噬菌體感染的免疫力[12]。(3)再者,在噬菌體進入細菌通過宿主環境合成所需元件后的組裝過程中也可能受到外來因素的干擾,導致噬菌體的組裝發生錯誤而影響其進一步增殖。研究顯示SaPI在搶奪噬菌體組裝元件過程中發揮了重要作用[13]。 最近,Doron等人在研究中發現了26個新的細菌抗噬菌體防御系統[4],在10個驗證的抗噬菌體防御系統中有5個在葡萄球菌基因組中有關聯,這可能意味著更多的防御機制和金葡菌抵抗噬菌體作用有關。本研究中發現的臨床菌株9號、14號、26號較標準菌株對該噬菌體更加敏感,對其深入研究可能揭示更多噬菌體宿主適應性的信息。

然而本研究依然存在局限性,例如未進行噬菌體SY01的測序和分類,無法全面了解其生物學特性;未對相關噬菌體敏感和耐受的臨床菌株進行基因分型以揭示各個不同特征臨床菌株對噬菌體敏感性的聯系,這也是本研究將來繼續進行的課題。

本研究從病人腸道分離得到一株可以裂解金黃色葡萄球菌的噬菌體,并針對此噬菌體對臨床菌株的裂解作用進行評價,揭示了此噬菌體對臨床金黃色葡萄球菌的裂解能力不受細菌耐藥性的局限,體外實驗和體內實驗證實,該噬菌體在臨床MSSA和MRSA中均有較好的活性,具有治療臨床金黃色葡萄球菌感染的潛在能力。