TAZ基因多態(tài)性與非賁門胃癌的關(guān)系

王巧巧,高 芳, 董文杰,閻小霞,陳雅茹,賈彥彬

胃癌(gastric cancer,GC)是一個(gè)全球性的健康問題,全球每年超過100萬人被診斷為胃癌,其依然是癌癥死亡的主要原因之一[1]。研究[2-7]表明,作為Hippo信號(hào)通路下游重要的效應(yīng)分子,含PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif,TAZ)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)。TAZ可作為多種癌癥的生物標(biāo)志物,同時(shí)也是胃癌防治的重要生物靶標(biāo)之一。因此,TAZ基因是胃癌變研究過程中的一個(gè)重要候選基因。該實(shí)驗(yàn)選取了包頭漢族人群作為研究對(duì)象,探討TAZ基因多態(tài)性與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系,進(jìn)而為非賁門胃癌的早期診斷、預(yù)防和治療提供實(shí)驗(yàn)支撐和理論依據(jù),也為臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 病例資料樣本納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)在文獻(xiàn)[8]中已有報(bào)道:選取在包頭地區(qū)生活5年以上的互無血緣關(guān)系的漢族人群,且3代以內(nèi)無與其他民族通婚史,其中病例組為2008—2020年期間在包頭市腫瘤醫(yī)院以病理學(xué)確診的非賁門胃癌病例460例,其中343例為男性,117例為女性,年齡為26～83(60.37±10.42)歲,并排除了繼發(fā)與復(fù)發(fā)型胃癌、接受過化療和放療的病例。正常對(duì)照為同期在包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院和內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院正常體檢者470例,其中男性324例,女性146例,年齡為33～93(59.08±10.71)歲,排除標(biāo)準(zhǔn)為有明顯的胃部疾病史、胃部手術(shù)、癌癥病史及遺傳病史、幽門螺桿菌清除治療史者。性別和年齡分布在正常對(duì)照組及非賁門胃癌病例組中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(年齡:t=-1.859,P=0.063;性別:χ2=3.632,P=0.057)。所有研究對(duì)象均簽署了知情同意書,該研究已得到包頭醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào):包醫(yī)倫審人體2021第(006)號(hào)。

1.2 方法

1.2.1單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)的選擇 選擇已有文獻(xiàn)[9-10]報(bào)道與疾病進(jìn)行過研究或位于TAZ基因編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)的SNPs,且其在中國漢族人群中最小等位基因頻率(minor allele frequency,MAF)>5%。該實(shí)驗(yàn)共篩選出rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239 4個(gè)SNP進(jìn)行研究。

1.2.2基因分型 提取所有樣本人全血基因組DNA,基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。用Primer 3在線軟件設(shè)計(jì)各位點(diǎn)的引物并由上海捷瑞生物工程有限公司進(jìn)行合成。25 μl PCR體系包含有:1 μl上游引物(5 μmol/L)、1 μl下游引物(5 μmol/L)、12.5 μl 2×Taq Master Mix、8.5 μl ddH2O、2 μl DNA模板(50 ng)。PCR反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min,94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸5 min。引物序列及PCR長度見表1。各位點(diǎn)PCR產(chǎn)物經(jīng)相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶作用,10 μl酶切體系為:1 μl 10×NE Buffer、2 μl PCR產(chǎn)物、0.4 μl限制性內(nèi)切酶、6.6 μl ddH2O。酶切產(chǎn)物通過2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,根據(jù)電泳結(jié)果顯示的片段大小判斷基因型,酶切片段及反應(yīng)條件見表2。

表1 TAZ基因各SNP位點(diǎn)的PCR引物序列及擴(kuò)增長度

表2 各SNP位點(diǎn)的酶切條件及酶切片段

2 結(jié)果

2.1 TAZ基因各SNP與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系在對(duì)照組中,TAZ基因rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239 4個(gè)位點(diǎn)的基因型分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(rs16861985:χ2=5.565,P=0.062;rs1055153:χ2=5.571,P=0.062;rs6783790:χ2=3.016,P=0.221;rs12490239:χ2=3.873,P=0.144)。

分析結(jié)果顯示:rs16861985在所有樣本中未出現(xiàn)GG基因型,其與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),與攜帶CC基因型者相比,攜帶GC基因型者非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加(OR=1.547,95%CI:1.145～2.089);rs1055153在共顯性、顯性、超顯性模型下均與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),其中顯性模型AIC(1 277.1)和BIC(1 296.4)的值最小,為最佳模型,與攜帶GG基因型者相比,攜帶GT+TT基因型者非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低(OR=0.570,95%CI:0.400～0.814); rs6783790、rs12490239與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)聯(lián)。見表3。

表3 TAZ基因各SNP與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系[n(%)]

2.2 TAZ基因單體型與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系對(duì)TAZ基因SNP rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239進(jìn)行單體型構(gòu)建并分析各單體型與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系,結(jié)果顯示C-G-A-A、C-G-A-G、C-G-G-A、C-T-G-A、G-G-A-G 5種單體型中,C-G-A-A單體型降低了非賁門胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR=0.761,95%CI:0.612～0.945);G-G-A-G單體型增加了非賁門胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)(OR=1.894, 95%CI:1.314～2.730);其他單體型與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)聯(lián)。結(jié)果見表4。

表4 單體型與非賁門胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系

2.3 SNP-SNP對(duì)非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的交互作用分析對(duì)TAZ基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行SNP-SNP交互作用分析,將性別和年齡納入?yún)f(xié)變量。通過交叉驗(yàn)證一致性最大、檢驗(yàn)準(zhǔn)確率最高和差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義篩選出最優(yōu)的交互模型。結(jié)果顯示,在非賁門胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中四階模型(rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239)存在交互作用(P<0.05)。見表5。

表5 SNP-SNP對(duì)非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的交互作用分析

3 討論

Hippo信號(hào)通路最早在果蠅的研究[11]中被發(fā)現(xiàn),是一條進(jìn)化上高度保守的激酶級(jí)聯(lián)通路,在細(xì)胞增殖、分化、先天免疫和再生的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TAZ作為Hippo通路的轉(zhuǎn)錄輔激活子及下游的重要效應(yīng)分子可與TEAD等轉(zhuǎn)錄因子相互作用,調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡。TAZ參與多種癌癥發(fā)生發(fā)展過程,包括癌細(xì)胞生長、遷移和多種惡性腫瘤的遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移[12-13]。

目前研究[14]表明,TAZ在胃腫瘤組織中的表達(dá)明顯高于正常組織,TAZ的表達(dá)與不良預(yù)后顯著相關(guān),與胃腺癌術(shù)后生存率呈負(fù)相關(guān);同時(shí)TAZ的表達(dá)還與胃腺癌的腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。TAZ被認(rèn)為是胃癌發(fā)生和不良預(yù)后的生物標(biāo)志物。因此,TAZ基因是胃癌變分子遺傳學(xué)研究的重要候選基因。該實(shí)驗(yàn)選擇了TAZ基因的4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239進(jìn)行研究,結(jié)果顯示SNP rs16861985、rs1055153與非賁門胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),rs6783790、rs12490239與非賁門胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)聯(lián)。

SNP rs16861985位于TAZ基因的內(nèi)含子區(qū),rs1055153位于TAZ基因的編碼區(qū),G突變?yōu)門導(dǎo)致脯氨酸到精氨酸的改變。Shen et al[9]研究表明rs16861985、rs1055153與中國肝癌患者的預(yù)后生存之間無關(guān)聯(lián)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SNP rs16861985與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),與攜帶CC基因型者相比,攜帶GC基因型者非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加;而SNP rs1055153也與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān),與攜帶GG基因型者相比,攜帶GT+TT基因型者非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低。因此,在包頭地區(qū)漢族人群中與CC基因型相比,TAZ基因SNP rs16861985的GC基因型可能是非賁門胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素;與GG基因型相比,TAZ基因SNP rs1055153的GT+TT基因型可能是非賁門胃癌發(fā)生的保護(hù)因素。該實(shí)驗(yàn)與Shen et al[9]的研究結(jié)果不同,可能是由于SNP rs16861985、rs1055153在不同的消化道腫瘤中所起的作用有所不同。

SNP rs6783790位于TAZ基因的內(nèi)含子區(qū),有文獻(xiàn)[10]報(bào)道SNP rs6783790與結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)無關(guān)聯(lián)。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)聯(lián)。該研究結(jié)果與Sebio et al[10]的研究結(jié)果提示SNP rs6783790可能在胃腸道腫瘤的發(fā)生發(fā)展中不起主要作用。

SNP rs12490239位于TAZ基因的5’UTR區(qū),可能具有潛在的調(diào)控作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在共顯性、顯性、隱性、超顯性4種遺傳模型中TAZ基因SNP rs12490239均與非賁門胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)聯(lián)。提示TAZ基因SNP rs12490239可能在非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)中不起主要作用,需要繼續(xù)擴(kuò)大研究樣本量,進(jìn)一步明確SNP rs12490239與非賁門胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)之間的關(guān)系。

采用SHEsis在線軟件對(duì)TAZ基因SNP rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239進(jìn)行單體型構(gòu)建,結(jié)果顯示,在C-G-A -A、C-G-A-G、C-G-G-A、C-T-G-A、G-G-A-G 五種單體型中,C-G-A-A單體型降低了非賁門胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn);G-G-A-G單體型增加了非賁門胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn);其他單體型與非賁門胃癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)聯(lián)。關(guān)于這4個(gè)SNP的單體型與非賁門胃癌的關(guān)系還需進(jìn)一步研究確證。

在該實(shí)驗(yàn)中,采用GMDR軟件對(duì)TAZ基因多態(tài)性位點(diǎn)rs16861985、rs1055153、rs6783790、rs12490239進(jìn)行SNP-SNP交互作用分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示在四階模型中,這些SNP在非賁門胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中存在交互作用。提示這四個(gè)SNP的交互作用在非賁門胃癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)中可能扮演了一定的角色。