miR-26a-3p靶向調控Survivin表達對H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷的影響

黃建成,李紅英,劉 佳,李青泉,張會軍,李小兵

近年,各種心臟病的發病率和病死率持續上升,已成為人類健康的頭號殺手,如先天性心臟病和缺血性心臟病。及時恢復心臟供血是預防心臟病最有效的手段,但恢復供血后,心臟反而加重損傷的現象稱為缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)損傷[1]。炎癥、自噬、細胞凋亡、鈣超負荷、神經體液激活和氧化應激等被認為是I/R損傷的主要原因[2]。因此,深入探討心肌I/R損傷,尋找新的戰略或藥物具有重要意義。微小RNA(microRNA,miRNA)參與心肌I/R損傷的病理生理學,其中,miR-26a與心肌細胞密切相關[3]。敲低miR-26a可顯著降低I/R誘導的心肌細胞凋亡,改善大鼠心臟功能[4]。miR-26a-3p對急性胰腺炎胰腺細胞增殖和凋亡有調控作用[5],但關于心臟I/R損傷的作用未見報道。結合生物信息學軟件的預測發現存活素(Survivin)可能是miR-26a-3p的靶基因。Survivin作為凋亡抑制蛋白,參與I/R誘導的心肌細胞凋亡[6]。該實驗以大鼠心肌細胞(H9c2)為對象, 用缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)模擬I/R損傷,探討miR-26a-3p對心肌I/R損傷的影響和作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料H9c2購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫;Lipofectamine?2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司;TaqMan miRNA反轉錄試劑盒、TaqMan miRNA定量PCR試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)、TB Green? Fast qPCR Mix購自日本TAKARA公司;miR-26a-3p inhibitor及其陰性對照inhibitor NC、miR-26a-3p mimics及其陰性對照mimics NC、Survivin基因siRNA干擾質粒(si-Survivin)及其陰性對照si-NC均購自廣州銳博生物科技有限公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司;細胞計數試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)購自美國MCE公司;Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體、B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體、活化型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)抗體、Survivin抗體和GAPDH抗體購自英國Abcam公司;Annexin V-FITC/ PI熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自武漢普諾賽生命科技有限公司;Dual-Lumi雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自武漢塞維爾生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及心肌細胞H/R損傷模型建立 將復蘇的H9c2細胞培養于高糖細胞培養基(含100 U/L青霉素、100 U/L鏈霉素、10%胎牛血清)中,置于37 ℃、5%CO2培養箱內培養,進行細胞傳代。取對數生長期H9c2細胞常規培養至70%融合度后,放入37 ℃含94%N2、5%CO2和1%O2的培養箱內缺氧培養6 h,再放置在37 ℃含95%O2和5%CO2的培養箱進行復氧培養。

1.2.2細胞轉染 將對數生長期H9c2細胞使用胰酶消化后接種于6孔板中(4×105個/孔),細胞密度達到80%時,根據Lipofectamin?2000轉染試劑說明書將miR-26a-3p inhibitor及其陰性對照inhibitor NC、Survivin基因siRNA干擾質粒(si-Survivin)及其陰性對照si-NC共轉染至H9c2細胞中,分為inhibitor NC組、inhibitor組、inhibitor+si-NC組和inhibitor+si-Survivin組,另設置空白對照組(blank組)。轉染48 h后,qRT-PCR和Western blot檢測驗證細胞轉染效率。

1.2.3分組處理 (1)取對數生長期H9c2細胞進行H/R干預,分組如下:常氧組:95%O2、5%CO2條件下培養;H6R2組:缺氧6 h復氧2 h;H6R4組:缺氧6 h復氧4 h;H6R8組:缺氧6 h復氧8 h;H6R12組:缺氧6 h復氧12 h。(2)經試驗(1)確定最佳復氧時間后,將轉染后的H9c2細胞進行H/R干預,分組如下:對照組(Control):未經轉染的H9c2細胞在95%O2、5%CO2條件下培養;缺氧/復氧組(H/R):未經轉染的H9c2細胞進行缺氧6 h復氧4 h;H/R+inhibitor NC組:轉染miR-26a-3p inhibitors NC的H9c2細胞進行缺氧6 h復氧4 h;H/R+inhibitor組:轉染miR-26a-3p inhibitor的H9c2細胞進行缺氧6 h復氧4 h;H/R+inhibitor+si-NC組:轉染miR-26a-3p inhibitor和si-Survivin-NC的H9c2細胞進行缺氧6 h復氧4 h;H/R+inhibitor+si-Survivin組:轉染miR-26a-3p inhibitor和si-Survivin的H9c2細胞進行缺氧6 h復氧4 h。

1.2.4CCK-8檢測 在96孔板中接種100 μl/孔的細胞懸液(2×107個/L),另設空白組接種培養基溶液,每組3重復。分組處理后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,置于37 ℃、5%CO2培養箱內孵育4 h;用酶標儀測定在450 nm處的吸光度值(OD)。細胞增殖活性以細胞存活率表示,細胞存活率(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%。

1.2.5比色法檢測 分組處理后,分別收集細胞上清液和細胞懸液(1×108個/L),按照試劑盒說明書檢測各組細胞中SOD活性、MDA含量及上清液中LDH釋放量。

1.2.6實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)檢測 分組處理后收集細胞沉淀,分別加入TRIzol試劑提取總RNA,經分光光度計鑒定,總RNA濃度和純度合格。qRT-PCR檢測細胞中miR-26a-3p的表達:按照TaqMan miRNA反轉錄試劑盒說明書進行操作將總RNA逆轉錄成cDNA。取2 μg cDNA進行PCR擴增,擴增條件按照TaqMan miRNA定量PCR試劑盒說明書進行,反應條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環;qRT-PCR檢測細胞中Survivin的表達:根據PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time)說明書進行操作合成cDNA,按照TB Green?Fast qPCR Mix說明書以cDNA為模板進行PCR反應,反應條件:94 ℃ 30 s,94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,40個循環。引物序列:miR-26a-3p引物F:5′-CTAGCG-CGATGCCGAACGTG-3′,R:5′-GCGTGAACGGCCGTGACG-3′;Survivin引物F:5′-GCATGGGTGCCCCG-ACG TTG-3′,R:5′-GCTCCGGCCAGAGGCTCAA-3′;U6引物F:5′-GAACGTGCCGGGCGTGCAG-3′,R:5′-GGTGAACGCCGTGGACGCC-3′;β-actin引物F:5′-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3′,R:5′-GGGCAC-GAAGGCTCATCATT-3′。miR-26a-3p以U6為內參,Survivin以β-actin為內參,采用2-△△Ct法計算miR-26a-3p和Survivin mRNA 的相對表達量。

1.2.7Western blot檢測 分組處理后收集細胞沉淀,進行蛋白提取并定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白,轉聚偏二氟乙烯膜,進行5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗Survivin抗體(1 ∶1 000)、Bax抗體(1 ∶1 000)、Bcl-2抗體(1 ∶1 000)、cleaved caspase-3抗體(1 ∶1 000)和GAPDH抗體(1 ∶1 000),于4 ℃孵育過夜。加入以辣根酶標記的二抗(1 ∶10 000)室溫振蕩孵育1 h,使用混合發光液曝光顯色,放入凝膠成像儀成像,采用Image J軟件計算蛋白條帶灰度值,以GAPDH為內參蛋白,計算目的蛋白的相對表達量=目的蛋白的灰度值/內參蛋白的灰度值。

1.2.8流式細胞術檢測細胞凋亡率 使用不含乙二胺四乙酸的胰酶消化收集分組處理后的細胞,取5×105個重懸細胞,加入500 μl稀釋的1×Annexin V Binding Buffer工作液重懸細胞,再依次加入 5 μl Annexin V-FITC和10 μl碘化丙啶染色液渦旋混勻,室溫避光孵育20 min,上流式細胞儀檢測。在散點圖上,細胞凋亡率(%)=晚期凋亡及壞死的細胞百分率(Q2-2)+早期凋亡細胞百分率(Q2-4)。

1.2.9雙熒光素酶報告基因實驗 Survivin蛋白由BIRC5基因編碼,查找BIRC5基因序列,利用Target Scan Human 7.1在線網站預測miR-26a-3p和Survivin的靶向結合位點。根據結合位點序列,設計合成野生型Survivin-3′-UTR(Survivin- WT)及突變型Survivin-3′-UTR(Survivin-MUT)片段序列,構建Survivin-WT和Survivin-MUT熒光素酶報告質粒。采用Lipofectamine 2000轉染試劑將miR-26a-3p mimics、mimics NC、Survivin-WT質粒和Survivin-MUT質粒分別轉染至對數生長期H9c2細胞中,共分為4組,每組設置3個復孔。轉染48 h后,加入Cell Lysis Buffer重懸細胞,收集細胞裂解物,按照雙熒光素酶報告檢測試劑盒說明書進行操作,并使用酶標儀分別檢測螢火蟲和海腎熒光素酶報告基因活性,相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性。

2 結果

2.1 H/R誘導對心肌細胞增殖活性的影響與常氧組比較,不同復氧時間組H9c2細胞增殖活性降低,差異有統計學意義(F=196.149,P<0.001),且隨著復氧時間的增加,H9c2細胞增殖活性呈現先降低后增加的趨勢。與常氧組比較,不同復氧時間組H9c2細胞上清液中LDH釋放量升高,差異有統計學意義(F=870.111,P<0.001),隨著復氧時間的增加,H9c2細胞上清液中LDH釋放量呈現升高后降低的趨勢,而H6R8與H6R12比較,細胞增殖活性[(72.67±3.06)%vs(69.00±2.65)%]和LDH釋放量[(72.02±1.90)U/Lvs(74.47±3.31)U/L]差異無統計學意義(P>0.05)。選擇缺氧6 h復氧4 h作為心肌細胞H/R損傷模型誘導條件。見圖1。

圖1 不同時間復氧處理對H9c2心肌細胞的影響

2.2 H/R誘導的心肌細胞中miR-26a-3p和Survivin表達水平與常氧組比較,不同復氧時間組H9c2細胞Survivin mRNA和蛋白表達水平降低,而miR-26a-3p表達水平升高,差異有統計學意義(FSurvivin mRNA=71.481,FSurvivin蛋白=179.429,FmiR-26a-3p=15.691,均P<0.001)。此外,隨著復氧時間的增加,Survivin mRNA和蛋白表達水平呈現先降低后升高的趨勢,而miR-26a-3p表達水平呈現先升高后降低的趨勢,而H6R8與H6R12比較,Survivin mRNA[(0.40±0.10)vs(0.38±0.06)]和蛋白表達水平[(0.36±0.06)vs(0.33±0.05)]及miR-26a-3p表達水平[(5.93±0.95)vs(6.08±1.02)]差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 不同時間復氧處理時H9c2心肌細胞中miR-26a-3p和Survivin表達水平

2.3 抑制miR-26a-3p表達對H/R干預下心肌細胞增殖活性的影響Western blot檢測結果顯示(圖3A),各組Survivin 蛋白表達水平差異有統計學意義

圖3 抑制miR-26a-3p表達對H/R干預下H9c2心肌細胞中Survivin蛋白表達水平和增殖活性的影響

(F=81.775,P<0.001)。與blank組(0.15±0.04)或inhibitor: NC組(0.16±0.08)比較,inhibitor組細胞中Survivin 蛋白表達水平(1.14±0.13)升高,差異有統計學意義(P<0.001);與inhibitor組比較,inhibitor+si-Survivin組細胞中Survivin 蛋白表達水平(0.43±0.10)降低,差異有統計學意義(P<0.001),而inhibitor+si-NC組(0.13±0.11)差異無統計學意義(P>0.05)。CCK-8結果顯示(圖3B),各組H9c2細胞增殖活性差異有統計學意義(F=252.637,P<0.001)。與Control組[(100.00±0.00)%]比較,H/R組H9c2細胞增殖活性[(48.03±2.00)%]降低,差異有統計學意義(P<0.001);與H/R組比較,H/R+inhibitor組H9c2細胞增殖活性[(83.80±1.94)%]升高,差異有統計學意義(P<0.001),而H/R+inhibitor NC組[(48.22±1.80)%]差異無統計學意義(P>0.05);與H/R+inhibitor組比較,H/R+inhibitor+si-Survivin組H9c2細胞增殖活性[(69.31±3.51)%]降低,差異有統計學意義(P<0.001),而H/R+inhibitor+si-NC組[(85.51±2.97)%]差異無統計學意義(P>0.05)。

2.4 抑制miR-26a-3p表達對H/R干預下心肌細胞SOD、MDA及LDH水平的影響各組SOD、MDA和LDH水平差異有統計學意義(FSOD=16.184,FMDA=21.495,FLDH=573.514,P<0.001)。與Control組比較,H/R組H9c2細胞SOD活性降低,MDA含量和LDH釋放量升高,差異有統計學意義(均P<0.001);與H/R組比較,H/R+inhibitor組H9c2細胞SOD活性升高,MDA含量和LDH釋放量降低,差異有統計學意義(均P<0.001),而H/R+inhibitor NC組差異無統計學意義(P>0.05);與H/R+inhibitor組比較,H/R+inhibitor+si-Survivin組H9c2細胞SOD活性降低,MDA含量和LDH釋放量升高,差異有統計學意義(P<0.05、P<0.01、P<0.001),而H/R+inhibitor+si-NC組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 抑制miR-26a-3p表達對H/R干預下H9c2心肌細胞SOD、MDA及LDH水平的影響

2.5 抑制miR-26a-3p表達對H/R干預下心肌細胞凋亡的影響各組細胞凋亡率及cleaved caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達水平差異有統計學意義(F細胞凋亡率=968.422,Fcleaved caspase-3=52.139,FBcl-2=76.854,FBax=32.703,P<0.001)。與Control組比較,H/R組H9c2細胞凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平升高,而Bcl-2蛋白表達水平降低,差異有統計學意義(均P<0.001);與H/R組比較,H/R+inhibitor組H9c2細胞凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平降低,Bcl-2蛋白表達水平升高,差異有統計學意義(均P<0.001),而H/R+inhibitor NC組差異無統計學意義(P>0.05);與H/R+inhibitor組比較,H/R+inhibitor+si-Survivin組H9c2細胞凋亡率及Bax和cleaved caspase-3蛋白表達水平降低,Bcl-2蛋白表達水平升高,差異有統計學意義(均P<0.001),而H/R+inhibitor+si-NC組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖5。

圖5 抑制miR-26a-3p表達對H/R干預下H9c2心肌細胞凋亡的影響

2.6 miR-26a-3p與Survivin的靶向關系qRT-PCR結果(圖6A)顯示,與blank組或inhibitor NC組比較,inhibitor組細胞中miR-26a-3p表達水平降低,差異有統計學意義[(1.00±0.04)/(1.00±0.04)vs(6.54±1.03),F=85.809,P<0.001]。Western blot結果(圖6B)顯示,與blank組或inhibitor NC組比較,inhibitor組細胞中Survivin蛋白表達水平顯著升高[(0.97±0.09)/(0.99±0.05)vs(3.87±0.53),F=86.894,P<0.001]。Target Scan 7.1在線網站顯示(圖6C),Survivin 3′-UTR區域存在與miR-26a-3p結合位點。雙熒光素酶報告結果顯示(圖6D),轉染miR-26a-3p mimics可降低Survivin-WT熒光素酶活性[(0.98±0.04)vs(0.26±0.06),F=339.234,P<0.001],但對Survivin-MUT熒光素酶活性差異無統計學意義[(1.00±0.00)vs(0.99±0.02),P>0.05]。結果提示miR-26a-3p可靶向調控Survivin表達。

圖6 miR-26a-3p靶向調控Survivin表達

3 討論

心肌I/R損傷可造成心肌細胞壞死、凋亡,脂質過氧化物增加和自由基大量生成,而細胞凋亡是I/R損傷的重要發病機制[7]。該研究表明,經H/R干預的H9c2細胞大量釋放LDH,細胞增殖活性降低,提示心肌細胞受損。隨著復氧時間的延長,心肌細胞受損情況有所改善,但無法達到正常狀態,說明I/R引起的損傷具有不可逆性。進一步研究表明,受損的心肌細胞中miR-26a-3p高表達,Survivin低表達。推測miR-26a-3p與Survivin可能參與心肌細胞損傷的作用機制。

多項研究[8-9]表明miRNA在I/R損傷中通過調控下游靶基因,影響心肌細胞凋亡,進而加重或減輕再灌注損傷。miR-26a-3p作為miRNA家族的一員,主要參與神經系統疾病,具有調節神經元凋亡和海馬體炎癥反應的作用[10-11]。但miR-26a-3p針對I/R損傷的研究鮮有報道。該研究表明,下調miR-26a-3p表達,可升高H/R干預下H9c2心肌細胞細胞增殖活性和SOD活性,降低MDA含量和LDH釋放量。提示抑制miR-26a-3p表達可減輕氧化應激,提高細胞活力,改善受損心肌細胞。

Survivin是一種在進化上高度保守的真核蛋白,具有抗細胞凋亡、抑制過度自噬、促進遷移和血管生成等作用[12]。cleaved caspase-3作為caspase-3活化形式,是參與細胞凋亡的重要蛋白酶[13]。Bcl-2和Bax相互關聯并相互制約,共同作用于下游caspase-3,調控細胞凋亡[14]。Survivin可減輕心肌I/R損傷,通過激活Survivin調控Bcl-2和Bax表達,達到抗凋亡的作用[15]。該研究表明,H/R組心肌細胞出現明顯細胞凋亡;經miR-26a-3p inhibitor處理后,Survivin呈高表達,細胞內Bax和cleaved caspase-3蛋白水平降低,Bcl-2蛋白水平升高,細胞凋亡減輕。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示,miR-26a-3p可靶向負調控Survivin。為了進一步驗證miR-26a-3p與Survivin的關系,將H/R干預的心肌細胞經miR-26a-3p inhibitor和si-Survivin共同處理后,結果顯示Survivin缺失可明顯逆轉miR-26a-3p inhibitor對心肌細胞損傷的改善。提示,miR-26a-3p可通過靶向負調控Survivin抑制心肌細胞凋亡。