天然小分子保護炎癥性腸病中腸上皮緊密連接屏障的研究進展

鐘玉婷,王志斌,張立超

(1.上海中醫藥大學附屬市中醫醫院藥學部,上海 200071;2.海軍軍醫大學麻醉系危重病醫學教研室,上海 200433)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)是因異常免疫反應介導的腸道慢性及復發性炎癥性疾病,主要包括克羅恩病 (Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)[1]。該病易導致嚴重的消化吸收障礙,病情反復,往往需要終身治療。目前IBD的治療藥物主要包括氨基水楊酸類、皮質類固醇類、傳統小分子免疫抑制藥和TNF-α單克隆抗體等[2],但這些藥物不良反應多,久用療效減弱、價格也比較昂貴。因此,尋找并開發治療效果確切、毒副作用小、價格低廉的藥物是特別迫切的。天然小分子產物結構多樣、效價高,具有很高的生物相容性,一直是新藥開發的源泉。研究表明,多種天然小分子化合物在IBD的體內外研究中都顯示出良好的治療效果。

IBD的發病機制至今尚未明確,但腸屏障功能受損引起腸道通透性增加在IBD發病中起著重要作用,而位于上皮細胞頂端的緊密連接在維持腸屏障功能中起著關鍵作用[3]。隨著現代藥理學和分子生物技術的快速發展,國內外眾多研究學者探討了天然小分子化合物通過改善腸上皮緊密連接結構和功能來維持和修復腸屏障功能的潛力(Fig 1)。本文根據國內外已有報道,對多種天然產物來源的小分子化合物在防治IBD腸上皮緊密連接損傷中的作用及其機制進行了綜述。

Fig 1 Natural small molecules protect intestinal epithelial tight junction barrier

1 IBD的發病機制

IBD是遺傳易感性和環境對菌群相互作用的結果,是通過削弱腸道屏障功能導致腸道免疫反應過度激活而引起的疾病[4]。腸道屏障包括機械屏障、化學屏障、微生物屏障和免疫屏障,其中機械屏障最為重要。機械屏障也被稱為物理屏障,由腸上皮細胞和細胞頂端的緊密連接構成,可有效阻擋病毒、細菌及內毒素等有害物質的進入[5]。環境污染、飲食結構改變等危險因素會導致腸道機械屏障受損,腸道通透性增加,進而導致IBD易發。

2 腸上皮屏障與緊密連接蛋白

腸上皮細胞之間的連接方式包括了緊密連接、縫隙連接、黏附連接以及橋粒連接。其中,位于細胞頂部的緊密連接是連接細胞間隙、調節腸黏膜通透性的關鍵。病理情況下,緊密連接的結構和功能會被破壞,進而導致腸屏障功能受損[5]。緊密連接是由Claudin、Occludin、連接黏附分子(junction adhesion molecular,JAM)和帶狀閉合蛋白(Zonula occludens 1,ZO-1)以及細胞骨架共同構成。其中,Claudin、Occludin 和JAM是連接細胞的跨膜結構蛋白。ZO-1則位于胞內,與細胞骨架肌動蛋白直接結合,同時也可以與細胞膜上閉鎖蛋白結合,在細胞骨架改變時直接影響緊密連接蛋白的正常防御功能[6]。

3 改善IBD腸上皮屏障功能的天然小分子化合物(Tab 1)

3.1 黃酮類化合物

3.1.1黃芩苷 黃芩苷是從傳統中藥黃芩根莖中提取分離出的一種黃酮類化合物,具有抑菌、利尿消腫、抗炎、抗腫瘤及解痙等藥理作用(Fig 2)。在TNBS誘導的小鼠結腸炎的模型中,黃芩苷不僅能減少IL-6、TNF-α和IL-1β的釋放以及增加IL-10的水平,還能提高ZO-1和β-catenin的表達,阻斷PI3K/AKT信號通路來增強腸上皮緊密連接屏障功能[7]。脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)可直接破壞細胞的緊密連接,進而可能會引起腸屏障功能障礙。體外研究發現,黃芩苷可以抑制LPS誘導IEC-6細胞及細胞間緊密連接破壞,其機制可能與抑制炎癥細胞因子的產生,上調ZO-1的mRNA和蛋白表達有關[8]。

Fig 2 Compound of flavonoids

Tab 1 Natural small molecules protect intestinal epithelial tight junction barrier in inflammatory bowel disease

3.1.2葛根素 葛根素為中藥葛根的主要活性成分之一,屬于藥食兩用的中藥活性成分,屬異黃酮類化合物,現已作為注射劑型上市(Fig 2)。葛根素具抗炎、抗過敏和改善微循環等藥理作用。吳軼[9]使用葛根素治療TNBS誘導的大鼠結腸炎,發現葛根素不僅可減少結腸中TNF-α、IL-6和IFN-γ的表達,還可逆轉大鼠結腸中Occludin、ZO-1和JAM-A等緊密連接蛋白的減少,有效地恢復了腸道屏障功能。

3.1.3山奈酚 山奈酚源自于姜科植物山奈的根莖,具有抗炎、殺菌和抗腫瘤等多種活性(Fig 2)。人結腸細胞系Caco-2單細胞層是一種被廣泛用于模擬腸上皮屏障的體外模型,山奈酚曾被報道具有增強Caco-2單細胞層緊密連接完整性的作用[10]。研究還發現,山奈酚可減輕脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)導致的腸道屏障損傷,通過增強Caco-2單層細胞跨膜電阻值(transepithelial electrical resistance,TEER),增加Claudin-3和ZO-1的表達水平來改善緊密連接完整性,從而維持腸道屏障穩態[11]。

3.1.4原花青素B2 原花青素B2(proanthocyanidin B2)是一種在自然界廣泛存在的天然黃酮類物,有多種藥理活性,如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、降壓、降脂和降血糖等(Fig 2)。原花青素B2安全性較高,可作為藥食兩用的活性成分,并且在人體的生物利用率也很高。研究發現,原花青素B2能夠有效降低TNBS結腸炎小鼠腸道對硫氰酸熒光素-葡聚糖的通透性,提高Claudin-1及ZO-1的表達水平,緩解腸道黏膜屏障損傷,其分子調控機制與黃芩苷相似,也與抑制PI3K/AKT信號通路有關[12]。

3.2 多酚類化合物多酚在自然界來源較廣,具有多種藥理活性,包括抗炎、抗氧化、抗腫瘤和殺菌等作用。此外,多項研究表明多酚類化合物對結腸炎和結直腸癌等疾病具有潛在保護作用,這可能與其改變腸道微生物區系和改善腸道屏障功能密切相關[13](Fig 3)。

Fig 3 Compound of polyphenol

3.2.1姜黃素 從傳統中藥姜黃、莪術中分離得到的有效成份姜黃素,可調控炎性免疫反應,且不良反應較少,安全性較高,已被證實可以緩解IBD。此外,研究還發現姜黃素可以增加受損Caco-2單細胞層的TEER值,降低熒光素鈉透過率,顯著提高Occludin蛋白的表達,進而維護緊密連接屏障的完整[14]。另一研究發現,在Caco-2細胞與分化的THP-1細胞的體外共培養模型中,姜黃素可明顯增加緊密連接蛋白ZO-1和Claudin-1的表達,進而減少腸上皮細胞的凋亡,增強了體外共培養模型中腸上皮屏障的完整性,潛在的機制可能是其抑制內質網應激和氧化應激及由此引發的細胞凋亡[15]。

3.2.2茶黃素 茶黃素是兒茶素的氧化偶聯二聚體,為紅茶中主要的多酚色素。研究發現,茶黃素可以通過激活腺苷酸活化蛋白激酶AMPK,進而減少多肽轉運體PEPT1在Caco-2單細胞層的轉運來抑制小肽的腸道轉運,AMPK的激活與腸上皮屏障功能的維持有著密切的關系[16]。Park等[17]的研究也證明,茶黃素可通過激活AMPK通路來增加緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達,同時降低腸道熒光素鈉透過率,改善腸屏障功能而緩解IBD。

3.3 萜類化合物萜類化合物作為天然產物中品種最為豐富的一類化合物,具有抗腫瘤、抗炎和殺菌等廣泛藥理活性(Fig 4)。

Fig 4 Compounds of terpenoid

3.3.1芍藥苷 芍藥苷為一種單萜類糖苷化合物,存在于中藥植物芍藥的根莖中,可降糖、抗腫瘤和調節免疫。在LPS刺激的Caco-2單細胞層模型中,芍藥苷可明顯提高TEER值,降低FITC-葡聚糖的通透性,并改善Occludin、ZO-1和Claudin-5的表達下調。同時,芍藥苷可抑制LPS刺激所誘導的環氧合酶2(COX-2)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)、TNF-α和IL-6的表達,其機制可能與激活Nrf2/HO-1信號傳導途徑,進而抑制NF-κB信號傳導有關[18]。肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)過度激活可導致緊密連接蛋白的表達下降,進而加重腸上皮屏障紊亂。在TNF-α刺激的Caco-2單細胞層模型中,芍藥苷呈劑量依賴性地抑制了MLCK的誘導型表達,同時抑制了緊密連接蛋白ZO-1的表達減少,進而恢復腸上皮緊密連接屏障功能[19]。

3.3.2青蒿素 青蒿素是從菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的一種具有過氧化基團結構的倍半萜內酯化合物,具有調節免疫、抗炎和抗腫瘤等生物活性。在LPS誘導的IEC-6細胞損傷模型中,青蒿素可減輕腸上皮細胞通透性,并劑量依賴性地上調緊密連接蛋白Occludin、Claudin-1和ZO-1的表達,這些作用與其抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路相關[20]。

3.3.3甘草酸 傳統中藥甘草在治療“久痢”具有良好的效果,甘草酸是甘草和炙甘草的質控成分,為萜類化合物中的三萜類皂苷類,可抗炎、減輕肝毒性以及增強腸道藥物吸收。有研究表明,甘草酸能夠劑量依賴性地增強DSS誘導的 UC模型小鼠腸黏膜緊密連接屏障功能,降低腸黏膜通透性,同時能夠有效抑制小鼠結腸組織中緊密連接蛋白Occludin、Claudin-2及Claudin-4的異常表達與錯誤定位[21]

3.4 生物堿類化合物

3.4.1小檗堿 小檗堿是從中藥黃連的根莖中分離而出的季銨生物堿,可抗炎、殺菌、緩解腹瀉和調節免疫系統(Fig 5)。小檗堿可以促進多種原因引起的腸道黏膜屏障損傷的修復,降低腸壁通透性,維持腸屏障功能,在實驗性UC模型中發揮良好的預防和治療作用。我們先前的研究表明,小檗堿治療可改善DSS-結腸炎小鼠的腸道屏障功能,抑制緊密連接蛋白ZO-1、E-cadherin和Occludin的下調,同時降低結腸組織中MPO的活性和促炎細胞因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的表達[22]。He等[23]通過LPS誘導大鼠腸道炎癥模型,結果顯示小檗堿可明顯抑制大鼠回腸組織中緊密連接蛋白Occludin和Claudin-1的表達降低,這與小檗堿激活IGF-1/IGFBP-3信號通路有關。

3.4.2吳茱萸堿 從天然植物吳茱萸的成熟果實中提取得到的生物堿類化合物吳茱萸堿,在抗腫瘤、抗炎、鎮痛、抑菌和降血脂等方面具有良好作用(Fig 5)。研究表明,吳茱萸堿可以修復TNBS誘導的結腸炎大鼠結腸的黏膜破壞。在LPS刺激的Caco2細胞中,吳茱萸堿可以減輕熒光素標記葡聚糖FD-4的通透率,增加TEER值,增加緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達,機制與其抑制NF-κB信號通路和NLRP3炎性小體相關[24]。

3.4.3氧化苦參堿 氧化苦參堿源自苦參根莖,在抗炎、抗腫瘤和心血管保護方面發揮良好效果(Fig 5)。有研究顯示,氧化苦參堿可治療DSS誘導的大鼠結腸炎。ROCK通路具有許多典型的下游因子,例如MLC和NF-κB,二者在IBD的發病機理中起著重要作用[25]。在一項研究中發現,氧化苦參堿呈劑量依賴性的上調UC模型小鼠腸上皮內緊密連接蛋白ZO-1和Occludin表達[26],可能與其抑制RhoA/ROCK 信號通路有關。

Fig 5 Compound of alkaloid

3.5 糖類化合物

3.5.1黃芪多糖 黃芪多糖從豆科植物黃芪根莖內的提取分離而得,在抗炎、抗病毒、抗腫瘤、保護肝腎和調節免疫等方面療效良好(Fig 6)。在DSS誘導的大鼠UC模型中,黃芪多糖可提高Occludin和ZO-1的表達來降低腸黏膜通透性和修復腸道上皮損傷,這一作用還體現在黃芪多糖有效減低了UC模型大鼠血清內毒素、D-乳酸以及二胺氧化酶的水平,其作用機制與調節 Bcl-2、Bax蛋白有關[27]。另有研究表明,黃芪多糖與苦參堿對TNBS誘導的大鼠UC模型具有協同保護作用,兩者合用可逆轉潰瘍性結腸炎大鼠結腸與肺組織中ZO-1與Occludin表達減少,降低UC大鼠便血指數評分,增加體質量,并有效改善結腸和肺組織病理損傷[28]。

3.5.2羧甲基茯苓多糖 茯苓在臨床上常用于治療胃腸道疾病,其主要活性成分茯苓多糖對胃腸道疾病有良好的防治作用(Fig 6)。β-茯苓聚糖與氯乙酸可在堿性條件中反應產生的一種水溶性良好的小分子化合物羧甲茯苓多糖。在TNF-α刺激的Caco-2單細胞層損傷模型中,羧甲基茯苓多糖有效逆轉了細胞緊密連接損傷,表現為顯著升高Caco-2單細胞層TEER值,以及上調 Occludin和ZO-3蛋白表達表達,機制可能與抑制NF-κB調控的MLCK-p-MLC信號通路有關[29]。

Fig 6 Compound of saccharide

3.5.3蘆薈多糖 蘆薈是一種藥用價值極高的天然植物,可通過調節緊密連接蛋白來減輕DSS誘導的大鼠結腸炎。蘆薈多糖類物質存在于蘆薈葉片凝膠中,具有抗炎、抗輻射、調節免疫和改善潰瘍病等作用。蘆薈多糖可通過上調Nrf2/HO-1信號通路和增加短鏈脂肪酸代謝改善小鼠急性結腸炎,并呈劑量依賴的方式增加結腸炎小鼠腸上皮細胞中ZO-1和Occludin的表達,維持腸屏障內穩態[30]。

4 總結與展望

眾多天然小分子化合物對腸上皮黏膜屏障都有積極的調節作用,提示在開發IBD治療藥物時,可以把同時具備改善腸屏障功能和抗炎效應的天然小分子作為候選化合物。盡管天然小分子化合物在治療IBD中有很大的潛力,但仍需要更多的研究來確定它們的安全性、有效劑量以及體內藥代動力學參數等。此外,大多數天然小分子調控緊密連接蛋白的上游信號通路不明確,靶點研究仍是重點和難點工作。因此,把天然產物來源的小分子化合物轉化為安全有效和作用機制明確的IBD治療新藥仍將面臨重大挑戰。