心腦舒通膠囊及有效成分對氧糖剝奪/復氧損傷腦微血管內皮細胞屏障完整性的影響及機制研究

王 萌,曹玉爽,郭莉琛,杜鑫苑,柴麗娟,袁 慶,胡利民

(天津中醫藥大學組分中藥國家重點實驗室、方劑學教育部重點實驗室、天津市中藥藥理學重點實驗室,天津 301617)

缺血/再灌注(ischemia-reperfusion injury,I/R)腦損傷情況下,可引起大量炎癥、白細胞黏附、活性氧化等級聯反應,破壞血腦屏障(BBB),從而導致神經元死亡[1-2]。腦微血管內皮細胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)是BBB的重要細胞成分,其細胞間緊密連接蛋白功能障礙會導致BBB完整性破壞,加重腦損傷[3-4]。心腦舒通膠囊(Xinnao shutong, XNST)是中藥蒺藜科屬植物蒺藜(TribulusterrestrisL. T)干燥地上全草提取制成的膠囊劑,臨床廣泛應用于腦缺血的治療[5]。前期研究發現,XNST及其3種單體成分(化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、原薯蕷皂苷)能促進OGD/R損傷星形膠質細胞神經因子釋放[6],且能明顯降低腦微血管內皮細胞炎癥因子TNF-α、IL-6的釋放[7]。本研究進一步通過考察其對OGD/R損傷后BMECs屏障完整性的保護作用及機制,為XNST治療缺血性卒中的臨床應用及其二次開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株及實驗試劑bEnd.3 細胞株(ATCC,美國);缺氧小室(STEMCELL,27310,加拿大);熒光素鈉(Sigma,美國);anti-lamin-B1 (ab171123)、Claudin-5 (ab15106)、Occludin (ab31721)、ZO-1(ab96594)購于美國Abcam公司;anti-p-JNK(#4668,Invitrogen公司);anti-JNK(#9252,Invitrogen公司);anti-p38(#9212)、anti-p-ERK1/2(#9101)、anti-ERK1/2(#9102)、 β-actin(#4967)、anti-p-IκBα(#2859)、anti-I kappa B kinase (IKK)(#2697)、anti-p-IKK (#2697)、anti-NF-κB/p65(#3032)均購于美國CST公司,Hoechst 33258 (Thermo,美國)。

1.2 實驗儀器37 ℃飽和濕度培養箱(Thermo,FORMA3111型,美國),倒置相差顯微鏡(Nikon,TE200,日本),多功能讀板機(TECAN,瑞士),低溫高速離心機(BECKMAN,64R型,美國),超微量核酸分析儀(Malcom,E-spect,日本),實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,7500型,美國),電阻儀(MERS00002,Millipore,美國),半干轉儀(Bio-rad,美國),熒光顯微鏡(Leica Microsystems,GER)。

1.3 方法

1.3.1藥物配制 XNST(批號:Z22021965,吉林敖東股份有限公司,中國):準確稱量XNST中的藥粉溶于無菌超純水,分別配制1、10 g·L-1濃度母液于100 ℃沸水中煮沸30 min后過0.22 μm一次性過濾器,用時以DMEM細胞培養液按1 ∶1 000稀釋。單體化合物:①化合物Ⅱ-14A(C61H100O13),②化合物Ⅱ-5A(terrestrinin A),③原薯蕷皂苷化合物(protodioscin):稱取各單體粉末溶于DMSO中配制成10 mmol·L-1母液,用時以DMEM細胞培養液按1 ∶1 000稀釋,單體化合物結構式如Fig 1所示。

1.3.2細胞培養 將bEnd.3細胞培養于含有10% 胎牛血清和100 kU·L-1鏈霉素和100 kU·L-1青霉素的DMEM中,在5% CO2、37 ℃飽和濕度培養箱中培養。

1.3.3細胞分組和處理 對照組(control):將培養液置換為高糖緩沖液,5% CO2、37 ℃培養箱正常培養4 h,4 h后置換為DMEM培養液,置5% CO2、37 ℃培養箱中繼續培養。

模型組(OGD/R):將培養液置換為無糖緩沖液,于缺氧小室內進行缺氧缺糖處理,向小室內持續充入94% N2+5% CO2+1% O2的混合氣體5 min后關閉缺氧小室,將小室放入 37 ℃孵箱中培養4 h后,換成DMEM培養液,置5% CO2、37 ℃培養箱中繼續培養。

加藥組:課題組前期研究發現,XNST在1、10 mg·L-1濃度能明顯降低OGD/R損傷bEnd.3細胞炎癥因子TNF-α的釋放[7],因此本研究繼續以1、10 mg·L-1濃度XNST深入考察其對OGD/R損傷bEnd.3細胞屏障功能的影響。具體操作為缺氧缺糖處理同模型組,4 h后加入含XNST(1、10 mg·L-1)或化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、原薯蕷皂苷(10 μmol·L-1)的DMEM培養液,并置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養。

1.3.4藥物對OGD/R損傷bEnd.3細胞跨膜電阻值(TEER)的影響 bEnd.3細胞按1×107L-1接種于Transwell小孔上層,連續檢測其電阻值變化,待電阻值達到穩定值之后,對細胞進行造模及加藥處理,具體操作方法及實驗分組如1.3.3所示。24 h后每孔分別從3個不同地方檢測電阻值,每組3孔,同時測量無細胞的空白Transwell培養液的電阻值作為基準值。

1.3.5藥物對OGD/R損傷bEnd.3細胞熒光素鈉透過率的影響 待 TEER 電阻值穩定后,用 1×PBS 溶液清洗 Transwell 內外兩側各 2～3次,向內側加入200 μL新鮮配制的含 Na-Flu(100 μg·L-1) DMEM 溶液,外側加入0.5 mL DMEM 溶液,置于37 ℃、5% CO2恒溫培養箱中避光孵育1 h。1 h后取外側100 μL溶液于96孔黑板中,將培養板放入熒光酶標儀中測定激發波長為485 nm,發射波長為530 nm的熒光強度。

1.3.6RT-PCR法檢測藥物對Claudin-5/Occludin/ZO-1 mRNA影響 bEnd.3細胞接種到6孔板,細胞分組及處理如1.3.3所述。24 h后用預冷的PBS輕洗細胞3次,用TRIzol法提取RNA。并按照SYBR GREEN PCR Master Mix試劑盒說明書進行擴增,用ABI 7500 RT-PCR 儀獲得每個樣品反應的CT值,將mRNA水平歸一化為GAPDH水平,并根據以下公式計算處理細胞相對于對照樣本的閾值循環(CT)值的變化倍數:變化倍數=2(-ΔΔCT)。所有樣本均重復分析3次。特異性引物對列于Tab 1。

Tab 1 Specific primer pairs

1.3.7藥物對相關蛋白表達的影響 bEnd.3細胞接種到6孔板,細胞分組及處理同1.3.3所述。24 h后用預冷的PBS輕洗細胞2次。每孔加入100 μL蛋白裂解液(含1%PMSF),于冰上震蕩裂解15 min,刮下細胞于4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min。小心吸取上清并用BCA法測定其蛋白濃度。經10% SDS-PAGE膠質進行電泳轉移到PVDF膜,將所述膜在室溫下用5%脫脂乳孵育2 h并且在4 ℃下用以下一抗孵育過夜:JNK、p-JNK、p38、p-p38、ERK1/2、p-ERK1/2、Claudin-5、 Occludin 、ZO-1、NF-κB/p65、I kappa B alpha (IκBα)、p-IκBα、I kappa B kinase (IKK)、p-IKK、β-actin、lamin-B1作為內參,4 ℃滾軸孵育過夜后用TBST漂洗相應PVDF膜5 min×4次。加入相應的二抗室溫下孵育1 h用TBST漂洗5 min×4次。用ECL化學發光試劑對PVDF膜進行顯影,使用ImageJ軟件從光密度值定量分析條帶。

1.3.8免疫熒光檢測Claudin-5/NF-κB的表達 將bEnd.3細胞培養在24孔板上,4%多聚甲醛固定15 min,0.1% Triton-X 100滲透10 min,3%牛血清白蛋白封閉細胞1 h,加入Claudin-5和NF-κB/p65一抗孵育。用PBS洗滌細胞3次,加入抗兔Alexa Fluor?488、抗兔Alexa Fluor?555于37 ℃孵育30 min。PBS輕洗3次,Hoechst 33258孵育5 min。PBS洗滌細胞3次后熒光顯微鏡下拍照。

2 結果

2.1 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細胞TEER值及Na-Flu透過的影響如Tab 2所示,與control比較,OGD/R組能明顯降低bEnd.3細胞的電阻值(P<0.01),增加Na-Flu透過率(P<0.01);與OGD/R比較,XNST(1、10 mg·L-1)及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin均能明顯增加損傷bEnd.3細胞的電阻值(P<0.01),降低Na-Flu透過率(P<0.01)。

Tab 2 Effect of drugs on TEER and Na-Flu permeability in damaged bEnd.3

2.2 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細胞Claudin-5熒光表達的影響如Fig 2顯示,control組Claudin-5熒光表達較強,且內皮細胞間緊密連接結構完整;與control組比較,OGD/R組Claudin-5的熒光強度明顯降低,細胞間緊密連接破壞(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin均能增強Claudin-5熒光表達,改善細胞間緊密連接結構(P<0.05);與XNST組比較,化合物Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5熒光表達(P<0.05)。

Fig 1 Structural formula of three monomer compounds

2.3 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細胞Claudin-5/Occludin/ZO-1 mRNA影響如Tab 3所示,與control組比較,OGD/R組能明顯降低bEnd.3細胞Claudin-5、Occludin、ZO-1的mRNA表達(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST、化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5的mRNA表達(P<0.01),XNST能明顯增加Occludin的mRNA表達(P<0.05),protodioscin能明顯增加ZO-1的mRNA表達(P<0.01);與XNST組比較,化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5的mRNA表達(P<0.05),protodioscin能明顯增加ZO-1的mRNA表達(P<0.01)。

Tab 3 Effect of drugs on Claudin-5/Occludin/ZO-1 mRNA in OGD/R-damaged bEnd.3

2.4 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細胞Claudin-5/Occludin/ZO-1 蛋白表達影響如Fig 3所示,與control組比較,OGD/R組能明顯降低bEnd.3細胞Claudin-5、Occludin、ZO-1的蛋白的表達(P<0.05);與OGD/R組比較,XNST能明顯增加bEnd.3細胞Claudin-5、Occludin的蛋白表達(P<0.05),化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A明顯增加bEnd.3細胞Claudin-5、Occludin、ZO-1的蛋白表達(P<0.05),protodioscin明顯增加bEnd.3細胞Claudin-5、ZO-1的蛋白表達(P<0.01);與XNST組比較,化合物Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加Claudin-5的蛋白表達(P<0.01),Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能明顯增加ZO-1的蛋白表達(P<0.01)。

Fig 3 Effect of drugs on expression of tight junction protein in bEnd.3 cells under OGD/R n=3)

2.5 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細胞MAPK蛋白磷酸化表達的影響如Fig 4所示,與control組比較,OGD/R組能明顯增加JNK、p38、ERK1/2磷酸化水平(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST明顯降低了p-JNK水平升高(P<0.05),但p-p38和p-ERK1/2沒有降低。與OGD/R比較,化合物Ⅱ-5A和protodioscin治療明顯降低p-JNK、p-p38和p-ERK1/2表達水平(P<0.05),化合物Ⅱ-14A對p-JNK、p-p38和p-ERK1/2水平沒有明顯影響。與XNST組比較,化合物Ⅱ-5A、protodioscin能明顯抑制ERK1/2蛋白磷酸化表達(P<0.01)。

Fig 4 Effect of drugs on phosphorylation expression of MAPK protein in OGD/R injury bEnd.3 cells n=3)

2.6 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細胞NF-κB的核轉位的影響免疫熒光染色檢測NF-κB的主要亞基p65是否被轉移到細胞核內,判斷NF-κB是否被激活。免疫熒光結果如Fig 5所示,與control組比較,OGD/R組NF-κB/p65的核轉位明顯增加;與OGD/R組比較,XNST、Ⅱ-14A、Ⅱ-5A和protodioscin均能明顯抑制NF-κB/p65的核轉位;與XNST組比較,protodioscin能明顯抑制NF-κB/p65核轉位(P<0.01)。

2.7 藥物對OGD/R 損傷bEnd.3 細胞NF-κB通路相關蛋白表達的影響如Fig 6所示,與Control組比較,OGD/R組細胞核中核NF-κB/p65水平明顯升高(P<0.01),bEnd.3細胞質中IκBα和IKK的磷酸化水平明顯增加(P<0.01);與OGD/R組比較,XNST、Ⅱ-14A、Ⅱ-5A和protodioscin的NF-κB / p65易位以及IκBα和IKK蛋白磷酸化明顯降低(P<0.01);與XNST組比較,protodioscin能明顯抑制IKK蛋白磷酸化(P<0.01)。

Fig 6 Effect of drugs on NF-κB protein expression in OGD/R injury bEnd.3 cells n=3)

3 討論

既往研究和臨床試驗均證實,XNST對腦缺血具有明顯作用,臨床應用于治療偏癱、語言障礙、動脈硬化等[8-9]。藥理學研究表明,XNST可通過抑制細胞凋亡和誘導血管生成促進急性腦缺血時MCAO/R大鼠的功能恢復[10]。BMECs具有緊密連接結構,限制細胞外物質運輸到腦,對維持腦內穩態至關重要[11]。BBB通透性增加可加重腦缺血后中樞神經系統損傷的發展[12]。緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin和ZO-1是腦內皮細胞維持緊密連接所必需的,它們可以密封相鄰內皮細胞之間的細胞間隙,為循環分子形成選擇性通透屏障[13]。本研究結果表明,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin能通過增加內皮細胞間緊密連接蛋白Claudin-5、Occludin和ZO-1的mRNA及蛋白表達水平,改善細胞間緊密連接結構,增加細胞間跨膜電阻及降低熒光素鈉透過性,從而促進內皮細胞屏障完整性,其中單體化合物protodioscin對Claudin-5及ZO-1的mRNA及蛋白表達作用明顯。

BMECs屏障功能受許多復雜的細胞信號通路和分子的調節[14]。MAPK是哺乳動物細胞中的Ser/Thr蛋白激酶,即c-jun N末端激酶(JNK)、細胞外信號相關激酶(ERK1/2)和p38蛋白[15]。NF-κB信號調節各種免疫和內皮屏障破壞的基因的表達,這些信號調節主要促炎細胞因子、黏附分子和緊密連接蛋白的上調[16]。本研究結果顯示,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin明顯抑制JNK、ERK1/2、p38的蛋白磷酸化,抑制MAPKs信號通路激活。且能明顯抑制NF-κB核轉位,抑制IκBα和IKK的磷酸化水平,表明其能通過抑制NF-κB通路激活來抑制炎癥反應和發揮保護內皮細胞屏障完整性作用,其中單體化合物protodioscin對NF-κB核轉位作用明顯。

綜上所述,本研究結果表明,XNST及化合物Ⅱ-14A、Ⅱ-5A、protodioscin可改善OGD/R損傷內皮細胞屏障完整性,穩定細胞間緊密連接結構,其機制可能與抑制NF-κB和MAPK信號通路激活有關,且單體化合物protodioscin對增加緊密連接蛋白表達及抑制NF-κB核轉位作用更為明顯。本研究結果可為XNST治療腦缺血的臨床應用提供藥理學依據,也為從植物藥中尋找具有促血腦屏障完整性腦保護作用的單體化合物提供參考。