高糖環境中雄激素受體對心肌成纖維細胞增殖和脂質合成能力的影響

溫 馨,周 洋,林麗嬋,劉芷言,宋 凱,陶 輝,臧洪梅

(1.安徽醫科大學藥學院,安徽 合肥 230032;2.安徽醫科大學第三附屬醫院藥學部,合肥市第一人民醫院, 安徽 合肥 230061;安徽醫科大學第二附屬醫院 3.心胸外科、4.麻醉科, 安徽 合肥 230601)

心血管的相關并發癥是糖尿病的首要致死原因,其中糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病特異性的心臟并發癥,主要是高血糖引起的微血管彌漫性損傷導致[1]。在排除冠狀動脈疾病、高血壓或瓣膜性心臟病等器質性心臟病后,DCM可發生心臟功能障礙,并與糖尿病患者的預后密切相關[2]。

其中,高血糖引起的心肌纖維化是糖尿病心肌病的重要病理生理過程,而在心肌纖維化中,心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts,CFs)的異常激活和增殖起到重要作用[3]。已經有研究報道,氧化應激、代謝異常均可以影響心肌成纖維細胞的增殖[4],在肺纖維化中發現[5]促纖維化TGF-β信號轉導需要脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN),但是目前脂質合成對心肌成纖維細胞增殖的研究較少。已經有研究報道雄激素受體(androgen receptor,AR)參與糖尿病心肌纖維化中的心肌成纖維細胞焦亡[6]和自噬[7]。同時,AR還參與腫瘤相關的脂質合成[8],促進腫瘤的增殖[8-9]。但是,AR是否能夠調控心肌成纖維細胞的脂質合成尚不明確。因此,本研究通過高糖刺激CFs構建體外模型,探討在高糖環境下,AR對CFs的脂質合成和增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 本研究使用新生1～3 d的C57BL/6乳鼠進行原代心肌成纖維細胞的提取,動物從安徽醫科大學動物實驗中心獲得,使用許可證號為SYXK(皖)2017-006。

1.1.2主要試劑 DMEM高糖培養基(武漢賽維爾公司);胎牛血清(Gibco公司);Ⅱ型膠原酶(德國Biofroxx公司);0.25%胰蛋白酶(碧云天生物有限公司);一抗抗體AR(22089-1-AP)、FASN(10624-2-AP)、PCNA(10205-2-AP)、Cyclin D1(26939-1-AP)、α-SMA(BM0002)、Collagen Ⅰ(14695-1-AP)、GAPDH(60004-1-Ig)均購于Proteintech公司; AR過表達質粒由合肥通用生物合成;逆轉錄試劑盒(艾瑞克生物公司);油紅O試劑(武漢賽維爾公司);CCK-8試劑盒(合肥Biosharp公司)。

1.1.3主要儀器 細胞培養箱(上海Heal Force公司);酶標儀(美國賽默飛公司);熒光顯微鏡(日本OLYMPUS公司);實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司);Nano Photometer分光光度計(德國IMPLEN公司);低溫高速離心機(德國EPPENDORF公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1原代心肌成纖維細胞的分離和培養 選取1～3天的新生乳鼠進行原代CFs培養,體表消毒后放入超凈工作臺中,于無菌大號細胞皿中進行心臟解剖。獲得心臟后,在預冷的PBS中清洗去除心腔中殘留的血液,并剪去多余的大血管和心臟表面的脂肪組織。心臟移入離心管中充分剪碎,并加入混合消化酶(0.25% 胰蛋白酶和0.2% Ⅱ型膠原酶以2 ∶1的體積比混合)進行37 ℃水浴消化。將消化液通過200目篩網過濾獲得細胞懸液,離心后留取細胞沉淀,加入DMEM高糖培養基重懸后種板。在培養2～3 h后進行換液去除未貼壁的細胞,剩下的貼壁細胞繼續培養。

1.2.2原代CFs的細胞轉染 待原代CFs生長至對數期進行轉染操作,棄去培養基后,使用無血清培養基進行轉染,配置適量轉染復合物并在室溫充分混合孵育10 min。完成孵育后將轉染復合物均勻滴加到各組CFs中,“8”字搖晃使培養體系充分混勻。轉染8 h后,更換完全培養基繼續培養,根據后續實驗要求收集各組實驗樣本。

1.2.3實驗分組 探究高糖對CFs影響的分組,空白對照組(blank control,Control組):不做任何處理組;高糖模型組(high glucose,HG組):高糖刺激CFs 24 h。探究高糖環境下過表達AR對CFs作用的分組,陰性對照組(negative control,NC組):在高糖刺激24 h后,進行空載質粒的轉染;AR過表達質粒組(AR-overexpression plasmid,pcDNA3.1-AR組):在高糖刺激24 h后,進行AR過表達質粒的轉染。

1.2.4細胞總RNA的提取及逆轉錄 取各組對數生長期的CFs進行總RNA提取,棄去培養基后使用PBS清洗細胞,預冷的TRIzol充分裂解細胞,加入氯仿(氯仿的體積為加入TRIzol體積的20%)富集RNA,在4 ℃低溫離心機離心后收集上層液相。加入適量異丙醇助沉后再次離心獲得總RNA,使用75%乙醇洗滌2次RNA后加入適量無酶水進行溶解。溶解后的RNA通過Nano Photometer光度計檢測濃度,根據逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄,將RNA逆轉錄成cDNA,并于-20 ℃保存。

1.2.5RT-qPCR檢測相關mRNA的表達 取各組cDNA樣本進行RT-qPCR實驗,依據試劑盒要求加入各組樣本配置成20 μL的反應體系,上機檢測mRNA的表達。本實驗所用的引物序列見Tab 1。最終檢測結果以GAPDH作為內參,每一組mRNA的相對表達量采用2-△△CT計算后進行數據統計。

Tab 1 RT-qPCR primer synthesis sequences

1.2.6Western blot檢測相關蛋白的表達量 根據實驗分組進行蛋白上樣,每孔蛋白的上樣量為25-30 μg,通過凝膠電泳分離蛋白,200 mA 恒流轉膜。將PVDF膜牛奶封閉后,進行一抗孵育過夜。GAPDH的一抗稀釋濃度為1 ∶5 000,AR、FASN、PCNA、cyclin D1、α-SMA、collagen Ⅰ的一抗稀釋濃度為1 ∶1 000。次日回收一抗后進行二抗孵育40 min,最后進行ECL顯影。

1.2.7CCK-8檢測細胞增殖能力的改變 取各組CFs以5×104個的數量進行96孔板種板,每組設置3個復孔。24 h后每孔中加入CCK-8試劑并繼續培養4 h,完成培養后通過酶標儀進行450 nm處的吸光度檢測。

1.2.8油紅O染色檢測細胞的脂質合成能力 取處在對數生長期的各組CFs進行實驗,棄去培養基后,PBS進行清洗3遍后,用4%多聚甲醛室溫固定15 min。PBS再次清洗后,使用60%異丙醇浸泡5 min,然后進行10min的油紅O染色。完成染色后,流水漂洗多余的染料,并進行蘇木精復染細胞核。最后加入油紅O Buffer浸潤細胞,1 min后棄去并加入蒸餾水覆蓋后鏡下(放大倍數200×)觀察染色結果。

1.2.9免疫熒光 取各組CFs進行細胞爬片,細胞匯合度在70%左右時進行免疫熒光染色。PBS進行清洗細胞3遍,再用4%多聚甲醛室溫固定15 min。再次清洗后,0.5% TritonX-100進行室溫通透10 min。山羊血清封閉1 h后進行α-SMA、collagen Ⅰ一抗孵育過夜(稀釋比例均為1 ∶200),次日清洗一抗后使用熒光二抗Alexa Fluor 488進行孵育,最后含DAPI的抗淬滅劑封片使用熒光顯微鏡進行觀察(放大倍數200×),并留存圖像。

2 結果

2.1 原代CFs培養及鑒定如Fig 1所示,在完成原代CFs提取后,分別于1 d和3 d在鏡下觀察CFs的生長狀態。1 d后已經完成貼壁的心肌成纖維細胞均呈不規則形或長梭形樣貼壁生長(Fig 1A),3 d的心肌成纖維細胞幾乎鋪滿整個視野,生長狀態良好,折光性強(Fig 1B)。通過波形蛋白的免疫熒光染色(Fig 1C)發現,細胞染色陽性率為96%,可以鑒定為心肌成纖維細胞。

Fig 1 Observation of primary cardiac fibroblast growth and immunostaining identification

2.2 高糖環境下,心肌成纖維細胞中脂質合成和細胞增殖能力的改變CFs種板后在高糖環境下培養24 h,通過油紅O檢測脂滴發現,高糖刺激的模型組中脂滴染色與對照組相比明顯增加,差異具有統計學意義(P<0.01),結果見Fig 2A。此外,CCK-8檢測CFs活性發現,在高糖刺激后,高糖模型組中CFs的細胞增殖能力相比對照組上升,差異具有統計學意義(P<0.01),見Fig 2B。

2.3 高糖環境下,心肌成纖維細胞中FASN和PCNA的變化為了進一步研究CFs中影響脂質合成和增殖改變的具體機制,分別通過Western blot和RT-qPCR檢測CFs中脂質合成酶(fatty acid synthase,FASN)、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)和細胞周期蛋白D1(cyclin D1)的蛋白及mRNA的變化。如Fig 3A所示,Western blot檢測發現,相比對照組,模型組CFs中FASN和PCNA的蛋白表達上調,差異具有統計學意義(P<0.05);如Fig 3B所示,通過 RT-qPCR檢測發現,模型組CFs中Fasn、Pcna和Ccnd1的mRNA表達相比對照組上調,差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.4 高糖環境下,心肌成纖維細胞中AR、collagen Ⅰ、α-SMA的變化AR是否能夠調控脂質合成以及脂質合成的異常是否影響心肌纖維化是我們感興趣的問題。因此,我們檢測了高糖環境下,CFs中AR、collagen Ⅰ、α-SMA的含量。如Fig 4A所示, Western blot檢測發現,相比對照組,模型組CFs中纖維化相關蛋白collagen Ⅰ和α-SMA的蛋白表達上調,但是AR的蛋白表達被抑制的,差異具有統計學意義(P<0.05);如Fig 4B所示,通過 RT-qPCR檢測發現,高糖刺激后CFs中Col1a1和Acta2的mRNA表達相比對照組上調,而Ar的mRNA水平降低,差異具有統計學意義(P<0.05)。此外,如Fig 4C所示,免疫熒光實驗也證明高糖模型組中的collagen Ⅰ和α-SMA的蛋白表達上調。

2.5 過表達AR后,心肌成纖維細胞中FASN、PCNA、Cyclin D1、collagen Ⅰ、α-SMA的變化如Fig 5A所示,Western blot檢測質粒轉染后的AR蛋白水平發現,AR的蛋白水平相比空載對照組升高,差異具有統計意義(P<0.05),證實過表達質粒載體轉染成功。同時,與空載對照組相比,FASN、PCNA、Cyclin D1、collagen Ⅰ、α-SMA的蛋白水平下降,差異具有統計意義(P<0.05)。如Fig 5B所示,通過 RT-qPCR檢測發現,在過表達AR后,CFs中Ar的mRNA水平升高而Fasn、Pcna、Ccnd1、Col1a1、Acta2的mRNA水平下降,差異具有統計學意義(P<0.05)。

2.6 過表達AR后,心肌成纖維細胞中脂質合成和增殖能力的改變在過表達AR后,通過油紅O檢測脂質發現,過表達組中脂質染色與對照組相比減少,差異具有統計學意義(P<0.05),見Fig 6A。此外,CCK-8檢測CFs活性發現,過表達組中CFs的細胞活性相比對照組下降,差異具有統計學意義(P<0.05),見Fig 6B。

Fig 2 Changes of lipid synthesis and cell proliferation capacity in cardiac fibroblasts under high glucose n=3)

Fig 3 Expression of FASN and PCNA in cardiac fibroblasts under high glucose n=3)

Fig 4 Expression of AR, collagen Ⅰ and α-SMA in cardiac fibroblasts under high glucose n=3)

Fig 5 Changes of FASN, PCNA, Cyclin D1,Ar,collagen Ⅰ and α-SMA in myocardial fibroblasts after

3 討論

DCM是糖尿病患者排除無器質性心臟病的存在,仍出現心臟結構和功能改變的糖尿病并發癥之一[10]。由于高糖引起的氧化還原的損傷,線粒體受損[11]和心肌纖維化等一系列病理變化會損害心肌收縮力和心臟功能,最終甚至會導致心衰的發生[10],同時脂質代謝在心衰中的作用也越來越受關注[12]。此外,在DCM中可以觀察到異常的脂質蓄積,產生的脂毒性會損傷心肌細胞[13]。豐富的脂質蓄積為細胞供能,促進腫瘤的增殖[14]。其中,FASN是參與脂肪酸生物合成的關鍵酶,也是肥胖、非酒精性脂肪性肝病等代謝性疾病的重要靶標[15]。在FASN缺失時,可以降低前列腺癌的侵襲性[16],同時抑制FASN和上游的甾醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element binding protein,SREBP)也是一種腫瘤潛在的治療策略[17]。在肺纖維化的研究中發現,FASN 的抑制可以降低了促纖維化靶標蛋白的表達,而且使肺功能得到改善[5]。本研究也發現類似的實驗結果,FASN 可能會是日后纖維化的治療靶點之一。

Fig 6 Changes of lipid synthesis and cell proliferation

CFs是參與心肌纖維化的主要效應細胞,但是脂質代謝的異常在CFs中的作用少有探究。AR作為核轉錄因子參與糖尿病心肌纖維化的表觀遺傳調控[18],但是AR對心肌成纖維細胞脂質合成的影響尚不明確。作為轉錄因子的AR可能結合SREBP或直接調控FASN的表達影響脂質合成為細胞增殖提供能量,還可能直接影響細胞周期相關蛋白等提供增殖所需的物質基礎。本研究通過體外實驗模擬高糖環境,探討CFs中脂質合成的變化和AR在脂質合成中的作用和可能機制。在高糖環境下,油紅O和CCK-8實驗表明CFs中脂質合成和增殖能力較空白對照組明顯增強。RT-qPCR與Western blot結果也表明,高糖環境下CFs中的FASN、PCNA、collagen Ⅰ、α-SMA表達升高,而AR的表達下調。在過表達AR后,CFs中的FASN、PCNA、collagen Ⅰ、α-SMA表達受到抑制;同時CFs中脂質合成和增殖能力相比空載體組減弱。綜上所述,本研究通過體外實驗證明,在高糖環境下,AR可能通過上調FASN促進CFs的脂質合成和增殖。實驗結果豐富了DCM的相關機制研究,也為日后DCM的診療提供了指導方向。