ACT001通過STAT1/CIITA/MHC-Ⅱ通路發揮抗炎抗氧化活性治療膿毒癥引起的急性肺損傷

盛 磊,周杰詩,韓 旭,李伊楠,劉慧娟,孫 濤

(南開大學藥學院,天津 300350)

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)為中度或輕度的急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),表現為進行性低氧血癥、呼吸困難和呼吸功增加[1],可由膿毒癥(Sepsis)或創傷等肺外原因引起,因其高發病率和死亡率,嚴重威脅人類健康。目前臨床上尚無特異性的治療方案,一般針對癥狀采取機械性通氣供氧進行支持性護理,但療效不佳,死亡率仍高達40%[2],因此急需有效治療藥物的出現。ACT001是二甲基胺含笑內酯(dimethylaminomicheliolide,DMAMCL)的富馬酸鹽形式,其易溶于水、原料廉價易得、制備工藝簡單成熟、成藥性好[3-5],具有抗多種腫瘤、白血病和免疫調節活性,且作為治療膠質母細胞瘤(glioblastoma,GBM)的孤兒藥,目前已被批準進行多項臨床試驗(ACTRN12616000228482,澳大利亞和新西蘭;ChiCTR-OIC-17013604,中國)。

NF-κB是膿毒癥病理進程中促進炎癥反應發生和擴大的關鍵因子,外源性刺激因子如脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)與Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)結合,激活核因子NF-κB,增加一系列促炎基因的表達,進而促進一系列炎癥因子如:TNF-α、IL-6等的生成與釋放[6],引起免疫因子風暴;過量的炎癥因子繼續誘導活性氧(reactive oxygen species,ROS)的產生和氧化應激[7],共同導致肺部的損傷與衰竭。

有大量研究報道ACT001能通過抑制NF-κB相關通路發揮一系列生物活性:ACT001可以通過抑制AKT磷酸化抑制小膠質細胞NF-κB核易位,從而抑制NLRP3炎癥小體活化,實現下調小膠質細胞的神經炎癥反應[8];ACT001可以直接結合IκκB,抑制其磷酸化,從而抑制NF-κB信號通路實現抑制膠質母細胞瘤生長[9]。

基于以上背景我們評價ACT001對膿毒癥引起的急性肺損傷的保護作用并探究其藥理機制,為急性肺損傷的研究與臨床治療提供新的方案。

1 材料

1.1 細胞RAW264.7(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞)購自南京凱基生物科技發展有限公司;

1.2 藥物與試劑RPMI 1640培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青/鏈霉素購自 Gibco 公司,ROS檢測試劑盒、一氧化氮檢測試劑盒和總SOD活性檢測試劑盒(WST-8法)購自碧云天生物技術有限公司;TNF-α、IL-6 EILSA檢測試劑盒購自武漢三鷹生物技術有限公司;RNA提取試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司;ACT001由南開大學陳悅教授提供。

1.3 實驗動物實驗動物品系為SPF級C57BL/6(6-8周)小鼠,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物使用許可證號為:SYXK(津)2019-0001。

2 方法

2.1 小鼠急性肺損傷模型的建立及給藥治療本研究建立腹腔注射LPS的小鼠膿毒癥急性肺損傷模型。對小鼠進行分組,分為:對照組(control)、模型組(LPS)、ACT001低劑量治療組(ACT001-L)和高劑量治療組(ACT001-H)。d1模型組和治療組小鼠按30 mg·kg-1腹腔注射LPS,對照組不做處理,治療組造模2 h后分別按照低劑量100 mg·kg-1,高劑量200 mg·kg-1腹腔注射ACT001溶液,每24 h再次給藥治療。自造模起,每12 h觀察小鼠生存狀態,并記錄小鼠體溫等數據。

2.2 細胞培養及分組RAW264.7細胞用含有10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液的RPMI 1640培養基置于37 ℃,5% CO2培養箱中進行培養,取對數生長期的細胞進行實驗,設置①對照組(control):正常培養的RAW264.7細胞組;②模型組(LPS):LPS濃度為1 mg·L-1;③ACT001低劑量治療組(ACT001-L):LPS濃度為1 mg·L-1,ACT001濃度為5 μmol·L-1;④ACT001高劑量治療組(ACT001-H):LPS濃度為1 mg·L-1,ACT001濃度為10 μmol·L-1。

2.3 小鼠肺泡灌洗液的收集造模24 h后,將小鼠安樂死,仰臥固定于操作臺上,暴露氣管,酒精棉球消毒,滯留針緩慢插入頸部氣管約1/3處,用預冷PBS沖洗肺部3次,每次0.4 mL,收集肺泡灌洗液(BALF)。灌洗液轉入EP管后立即置于冰盒中,1 000 r·min-1、4 ℃離心5 min,取得的上清用于蛋白質含量的測定,下層沉淀用紅細胞裂解液處理后用流式細胞術檢測中性粒細胞水平。

2.4 組織病理學評估急性肺損傷程度造模第7天將各組小鼠安樂死,取肺組織用10%福爾馬林固定,流水沖洗,常規脫水、石蠟包埋切片后進行蘇木精-伊紅(HE)染色,在顯微鏡下觀察肺組織的損傷情況。

2.5 肺濕干比測量造模24 h后,將小鼠安樂死,取出完整的肺立即稱重為濕重,隨后將肺組織置于EP管中開蓋于烘箱中60 ℃烘至恒重即為干重。濕重除以干重即為肺濕干比。

2.6 流式細胞術

2.6.1MHC-Ⅱ檢測 取給藥培養24 h后的各組細胞,吸棄培養基,PBS清洗2次,加入胰酶消化后加完全培養基終止消化,800 r·min-1離心5 min,PBS重懸得到單細胞懸液,加入MHC-Ⅱ抗體,4 ℃孵育45 min,離心棄上清,再加二抗4 ℃避光孵育30 min,PBS清洗后過濾網,用流式細胞儀進行檢測。

2.6.2中性粒細胞檢測 取肺泡灌洗液離心后得到的細胞沉淀用紅細胞裂解液處理,PBS重懸得到單細胞懸液,加入Ly6G和CD11b抗體避光孵育45 min,PBS洗去抗體后過濾網,用流式細胞儀進行檢測。

2.6.3ROS檢測 制備同“2.6.1”中的單細胞懸液,按照ROS檢測試劑盒說明書進行處理,最后用流式細胞儀進行檢測。

2.7 ELISA取上述收集到的血清和培養基上清,嚴格按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-6、TNF-α的含量。

2.8 Western blot細胞培養給藥24 h后,提取各組細胞總蛋白,采用BCA蛋白定量法檢測各組細胞蛋白濃度,99 ℃滅活蛋白10 min,SDS-PAGE凝膠電泳,轉膜,5%脫脂奶封閉3 h,一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h,ECL顯色并用成像儀進行顯影。

2.9 qRT-PCR用RNA提取試劑盒提取給藥培養24 h后的各組細胞的總RNA,參照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA,引物序列由擎科生物合成,詳見Tab 1。加入cDNA模板對Arg-1、iNOs、SOD基因進行PCR擴增,以GAPDH為內參照,采用△△CT值法測定各基因表達水平。

Tab 1 Primer sequence for real time PCR

2.10 NO含量和總SOD活性的測定取給藥培養24 h后的各組細胞,取上清按照一氧化氮檢測試劑盒說明書測定NO含量,取細胞按照總SOD活性檢測試劑盒檢測總SOD活性。

2.11 質譜分析取給藥培養24 h后的各組細胞,提取總蛋白質,膠內酶解,多肽在0.1%的甲酸中重新懸浮,離心,并注入三重四離子阱和Orbitrap質譜儀,所有MS原始數據均使用MaxQuant進行分析。

3 結果

3.1 ACT001對小鼠急性肺損傷模型的治療作用

3.1.1ACT001改善急性肺損傷小鼠的一般生活狀態,延長生存期并維持體溫恒定 ACT001結構如Fig 1A所示,在體內代謝為活性成分含笑內酯(micheliolide,MCL)(Fig 1B),建立膿毒癥誘發急性肺損傷模型后給藥,實驗過程中觀察小鼠一般生活狀態:對照組小鼠行為活躍,皮毛柔順、有光澤,呼吸平穩,排便正常;與對照組小鼠相比,模型組小鼠行動遲緩,多數呈蜷縮狀,汗毛直立,出現寒顫,肛門處有糞便凝固粘連毛發;ACT001治療組小鼠隨治療劑量增加,生存狀態較模型組有明顯改善。

Fig 1 The chemical structure of ACT001 and MCL

生存情況顯示:模型組小鼠在造模的60 h內出現了大規模的死亡,與之相比,治療組小鼠,尤其是高劑量組的死亡率明顯降低(Fig 2A)。實驗中發現小鼠的死亡往往伴隨著較低的體溫(<33 ℃),與對照組相比,模型組在造模后48 h內平均體溫明顯降低(P<0.01);與之相比,治療組小鼠的體溫提高且穩定,尤其是高劑量治療組在造模后24、36、48 h較模型組都有顯著性差異(P<0.01)(Fig 2B)。可見ACT001在急性肺損傷的早期和癥狀高峰期就能發揮良好的治療作用,抑制疾病進展。

3.1.2ACT001改善急性肺損傷小鼠肺組織病理 HE染色(Fig 3A)結果顯示:對照組小鼠肺組織結構正常,肺泡結構完整且排列整齊,肺泡間隙無出血和炎性細胞浸潤現象;模型組小鼠肺組織結構紊亂,肺泡結構被明顯破壞,出血嚴重,可見大量炎性細胞浸潤;高劑量治療組小鼠較模型組情況得到了極大改善,出血與炎性細胞浸潤明顯減輕,肺泡結構相對完整,低劑量治療組仍有輕微出血現象,但仍明顯優于模型組。肺損傷評分(Fig 3B)結果與HE染色結果相一致。由此可見,ACT001劑量依賴性地改善LPS誘導的急性肺損傷。

Fig 2 Effect of ACT001 on percent survival and temperature

3.1.3ACT001緩解急性肺損傷小鼠肺水腫情況 模型組小鼠因肺組織結構受損、肺泡結構被破壞,出現嚴重的出血和炎性滲出,由Fig 3C可見其肺濕干比較對照組明顯上升(P<0.01),呈現肺水腫狀態。在ACT001的治療下,肺濕干比較模型組降低,其中高劑量治療組下降程度更加明顯(P<0.01),可見ACT001劑量依賴性地改善急性肺損傷小鼠肺水腫情況。

3.1.4ACT001改善肺組織中蛋白質滲出和中性粒細胞浸潤 流式細胞術檢測肺泡灌洗液中中性粒細胞水平,結果顯示:模型組小鼠肺泡灌洗液中中性粒細胞水平較對照組明顯增加(P<0.01),而在接受ACT001治療后,低、高劑量治療組肺泡灌洗液中中性粒細胞水平均大幅度下降(P<0.01)(Fig 4A,B);BCA法檢測BALF中蛋白質濃度(Fig 4C),結果顯示:模型組蛋白質濃度較對照組明顯增加(P<0.01),而在ACT001作用下劑量依賴性降低(P<0.01);綜合以上結果表明:ACT001可緩解急性肺損傷小鼠肺部的蛋白質滲出和炎性細胞浸潤。

3.1.5ACT001降低急性肺損傷小鼠血清中炎癥因子濃度 ELISA檢測血清中炎癥因子水平(Fig 4D,E),結果顯示:模型組的TNF-α及IL-6含量較對照組均明顯升高(P<0.01),而在高劑量ACT001治療下明顯降低(P<0.01)。

3.2 ACT001改善LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應

3.2.1ACT001促進RAW264.7細胞M2 抗炎極化,抑制M1促炎極化 Western blot結果如Fig 5A所示,以β-actin為內參,在LPS刺激下,RAW264.7細胞的iNOs蛋白相對表達水平明顯上升,而在ACT001作用下,其表達水平劑量依賴性下降,Arg-1的蛋白表達水平趨勢與之相反。qRT-PCR(Fig 5B)結果和Western blot結果相一致。共同說明:ACT001劑量依賴性地促進RAW264.7細胞M2抗炎極化,抑制M1促炎極化。

3.2.2ACT001抑制RAW264.7細胞產生 NO Griess法測定各組RAW264.7細胞產生的NO水平,如Fig 5C所示,模型組與對照組相比,LPS誘導的RAW264.7細胞中NO濃度明顯上升(P<0.01);ACT001低、高劑量組與模型組相比,NO含量均明顯下降(P<0.01)且呈現劑量依賴性。

3.2.3ACT001抑制RAW264.7細胞產生炎癥因子 ELISA檢測各組RAW264.7細胞產生的相關炎癥因子水平(Fig 5D),結果顯示:LPS炎癥模型組的TNF-α及IL-6水平較對照組明顯升高(P<0.01),而在ACT001影響下劑量依賴性降低(P<0.01)。

3.3 ACT001改善LPS誘導的RAW264.7細胞氧化應激

3.3.1ACT001清除ROS 流式細胞術檢測各組RAW264.7細胞產生的ROS水平,結果如Fig 6A,B所示:LPS刺激下,ROS陽性的細胞比例較對照組明顯增加(P<0.01),而在ACT001影響下,與模型組相比,ACT001低、高劑量組ROS陽性細胞比例分別下調約11.1%和33.4%(P<0.01)。

3.3.2ACT001促進SOD mRNA的表達,增加SOD活性 qRT-PCR檢測各組RAW264.7細胞的SOD mRNA的表達水平(Fig 6C),總SOD活性檢測試劑盒檢測總SOD活性(Fig 6D),兩者結果相一致:模型組較對照組的SOD mRNA水平和蛋白活性下降(P<0.01),ACT001低、高劑量組較模型組均上升(P<0.01)。

3.4 ACT001主要通過MHC-Ⅱ途徑改善急性肺損傷提取各組不同處理RAW264.7細胞的蛋白質進行質譜檢測及KEGG通路富集分析(Fig 7A),將在模型組中上調的通路與給藥后下調的通路取交集發現,ACT001可能主要是通過影響抗原處理與呈遞通路發揮治療膿毒癥誘發的急性肺損傷的作用。

Fig 4 Effect of ACT001 on BALF and inflammation factors in serum in LPS-induced ALI

Western blot檢測抗原處理與呈遞通路中關鍵蛋白p-STAT1、CIITA和MHC-Ⅱ的表達水平,發現LPS刺激下,RAW264.7細胞中p-STAT1、CIITA和MHC-Ⅱ的蛋白表達水平明顯增加,而在ACT001作用下,尤其在高濃度ACT001環境中,三者的蛋白水平明顯下降(Fig 7B);進一步地,我們標記了RAW264.7細胞表面的MHC-Ⅱ蛋白,用流式細胞術進行分析驗證,結果(Fig 7C,D)與Western blot結果相一致。綜合以上結果表明ACT001能夠通過抑制STAT1的701位酪氨酸磷酸化,抑制轉錄因子CIITA產生,從而抑制MHC-Ⅱ的表達,抑制抗原處理與呈遞過程發揮抗炎、抗氧化作用,最終實現治療膿毒癥誘發的急性肺損傷。

4 討論

膿毒癥仍然是重癥監護病房(intensive care unit,ICU)死亡的主要原因,也是一項重大的全球公共衛生安全挑戰。膿毒癥會引起多器官損傷衰竭,而肺是其首先損害的重要器官,可導致急性肺損傷,最終導致死亡[10]。革蘭陰性菌的LPS結合細胞表面Toll樣受體,引起過度的先天性免疫反應,在肺部表現為產生大量的炎癥因子、引起免疫細胞的招募和活化并產生過量的ROS[11],導致血管通透性增加、正常內皮屏障功能持續喪失以及肺泡結構受損,正常的肺微循環遭到破壞,導致富含蛋白質的肺水腫積累,影響肺換氣功能,表現為進行性動脈低氧血癥、呼吸困難和呼吸功明顯增加,最終導致個體死亡[12]。其藥物開發大多都停留在臨床前階段,臨床上也缺乏十分有效的藥物,因此,尋找有效的靶點與藥物是當前急需解決的問題。

Fig 5 Effect of ACT001 on anti-inflammatory activity of RAW264.7 cells under LPS

Fig 6 Effect of ACT001 on antioxidative activity of RAW264.7 cells under LPS

Fig 7 Effect of ACT001 on different pathways of RAW264.7 cells under LPS

急性肺損傷的病理生理進程復雜,目前還沒有完全闡明其發病機制,可由創傷感染等因素引起,所以本研究采取腹腔注射LPS的方式引起的全身免疫因子風暴,構建小鼠急性肺損傷模型。其病理進程中大量免疫細胞如中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞在肺部被招募和激活[13],其中中性粒細胞在急性肺損傷的進程中發揮著核心作用[14],其活化可增加肺泡-毛細血管屏障的通透性,導致ROS產生,增加局部炎癥從而導致肺組織損傷[15]。本研究結果顯示:在個體水平上,ACT001維持模型小鼠體溫恒定,提高存活率;在組織水平上,ACT001能明顯減輕肺部的中性粒細胞浸潤,保護肺泡結構,減少滲血和蛋白質滲出,改善肺水腫情況,降低血清中炎癥因子水平,并呈現出劑量依賴性。全面而有力地證明了ACT001對膿毒癥引起的急性肺損傷具有良好的治療作用。

大量證據[13,15-16]表明,炎癥反應和氧化應激是急性肺損傷病理進程中對機體造成損傷的兩種重要途徑:外源性物質結合相關受體,如TLRs,通過病原體相關分子模式(pathogen-related molecular patterns,PAMPs)或損傷相關分子模式(damage-related molecular patterns,DAMPs),激活核因子NF-κB,誘導一系列炎癥因子釋放引起免疫因子風暴;免疫因子的大量產生進一步誘導氧化應激和ROS的產生[7],導致個體的肺血管內皮損傷,引起出血和免疫細胞浸潤,最終導致死亡。

NF-κB-誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOs)-NO信號通路是一條重要的氧化應激通路,而iNOs也是RAW264.7細胞促炎M1極化的標志物。Western blot和qRT-PCR結果共同表明:ACT001促進LPS處理的RAW264.7細胞由促炎M1極化類型向抗炎M2極化類型轉變,降低NO、IL-6、TNF-α的產生與釋放,抑制炎癥反應擴大。ROS的流式細胞術結果顯示:在ACT001治療下,接受LPS刺激的RAW264.7產生的ROS大幅度下降,且呈現劑量依賴性;通過對總SOD活性和SOD mRNA的表達水平進行檢測,推測可能是ACT001促進SOD的產生來發揮清除ROS的作用。從而證明了ACT001對炎癥反應和氧化應激這兩條關鍵損傷通路都能發揮良好的治療作用。

最后通過質譜檢測并進行KEGG通路富集,探究ACT001治療急性肺損傷的機制,發現抗原處理與呈遞通路在LPS刺激下明顯上調而在ACT001處理下發生下調,推測其是ACT001發揮作用的關鍵通路。巨噬細胞是專業抗原呈遞細胞之一(antigen-presenting cells,APCs),組織相容性復合體2(MHC-Ⅱ)是其抗原處理與呈遞過程中的重要分子,磷酸化的STAT1可生成二聚體,激動MHC-Ⅱ基因的轉錄因子CIITA,從而促進MHC-Ⅱ基因的轉錄、翻譯,生成大量MHC-Ⅱ蛋白[17];抗原在溶酶體等細胞器處理下產生抗原肽,與MHC-Ⅱ分子在細胞內結合,并被運輸到細胞膜上,被CD4+T細胞識別結合,進而引起下游的一系列免疫反應,包括炎癥和氧化應激等[18]。我們使用Western blot檢測了p-STAT1、CIITA和MHC-Ⅱ的蛋白表達水平,證明了ACT001可以抑制STAT1的701位酪氨酸磷酸化,抑制CIITA的產生,從而抑制MHC-Ⅱ基因的表達,抑制抗原處理與呈遞;我們還進一步通過流式細胞術檢測不同處理下細胞表面帶有MHC-Ⅱ蛋白的RAW264.7細胞比例,結果也與Western blot結果相一致,進一步證明了ACT001對MHC-Ⅱ通路的抑制作用。

綜上所述,ACT001可以通過抑制STAT1的701位酪氨酸磷酸化,抑制CIITA的產生,從而抑制MHC-Ⅱ基因的表達,抑制抗原處理與呈遞通路,在炎癥反應和氧化應激層面都發揮活性,有效緩解膿毒癥引起的急性肺損傷的肺水腫、蛋白質滲出和炎性細胞浸潤等肺部損傷,維持個體體溫穩定,提高存活率,從而治療膿毒癥引起的急性肺損傷。

此外ACT001也具有良好的生物安全性和穩定性,并且原料廉價易得,有望作為“老藥新用”型藥物開發成為治療膿毒癥引起的急性肺損傷的新藥。