基于網絡藥理學和分子對接探討芪術抗癌方治療原發性肝癌的分子機制

馬夢情, 孫嘉玲,胡 銳,3,馮文杏,韓志毅, 孫新鋒,馬文峰,張 衛,陳劍平,周小舟

[1. 廣州中醫藥大學第四臨床醫學院,廣東 廣州 510006;2.深圳市中醫院國家臨床肝病(中醫)重點專科,廣東 深圳 518033;3. 澳門科技大學中醫藥學院,澳門 999078;4. 深圳市中醫院中藥制劑研究重點實驗室,廣東 深圳 518033]

原發性肝癌(primary liver cancer,PLC)屬于惡性腫瘤,發病率逐年增加,死亡率位居全球癌癥第二[1]。西醫對于PLC的治療方式有限,且大部分患者發現時已處于中晚期,治療上以介入、放化療為主,后期副作用較大,易復發以及預后差[2]。隨著中醫藥在癌癥中的參與度逐漸增加,中醫在改善腫瘤患者癥狀、生活質量以及縮小病灶等方面存在獨特優勢[3]。中醫認為肝癌致病主要與正氣虧虛,臟腑功能氣血失衡,氣機郁滯,痰瘀釀毒久羈,從而有形腫塊盤踞腹內。芪術抗癌方(Qizhu anti-cancer prescription,QZACP)由廣州中醫藥大學第四臨床醫學院肝病專家周小舟教授擬定,已應用于臨床近十年,并獲得了國家發明專利(專利號:ZL20161 0843303.9)。該方針對PLC本虛標實的基本病機,以扶正抗癌為基本治療原則,其中黃芪、白術、黨參補脾益氣,山藥健脾補腎,雞內金既可軟堅又可散結,柴胡疏肝行氣,莪術、白花蛇舌草活血逐瘀,炙甘草調和諸藥,全方共奏健脾益氣,活血化瘀之效[4]。前期研究表明,QZACP聯合經肝動脈化療栓塞術(Transcatheter Arterial Chemoembolization,TACE)較單純TACE相比可以改善PLC患者的生活質量,延長存活時間[5]。并通過體外實驗發現QZACP方可以影響肝癌細胞上皮間質化[6],但其相關機制尚未闡明。網絡藥理學利用大數據平臺從多層面闡述中藥復方的作用機制,通過確定藥物-疾病的共同靶點,蛋白互作,相關通路富集分析以及分子對接預測和體內實驗,為驗證QZACP治療PLC提供有效及合理依據,為進一步研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學研究

1.1.1數據庫與軟件 研究所用數據庫與軟件,見Tab 1。

1.1.2芪術抗癌方成分及靶點的篩選 通過中藥系統藥理學數據庫(TCMSP)檢索出QZACP中黃芪、白術、白芍、柴胡、山藥、薏苡仁、白花蛇舌草、莪術、雞內金、甘草十種藥物的靶點成分。以生物口服利用度OB≥30%、藥物相似性DL≥0.18對成分進行篩選。由于TCMSP數據庫獲得“莪術”相關化合物較少,另外沒有“雞內金”的相關化合物,因此利用BATMAN-TCM數據庫,以截止值Score cutoff ≥20且P-value cutoff<0.05為篩選條件,得到成分在Pubchem及Swiss Target Prediction數據庫將靶蛋白進行處理。將各數據庫篩得的成分相關靶點去除重復后合并,得到QZACP的成分靶點數據集,利用Uniprot數據庫將得到的靶蛋白名稱進行處理。

1.1.3原發性肝癌(PLC)靶點的收集及藥物靶點預測 在OMIM、Drugbank、GeneCards數據庫中分別檢索關鍵詞“hepatocellular carcinoma”“Liver cancer”來獲取PLC的疾病靶點。通過Uniprot數據庫中將靶點簡稱進行處理,并構建PLC的疾病靶點數據集。取QZACP篩得成分和PLC的交集靶點后繪制venn圖。

1.1.4中藥復方網絡構建 對QZACP成分與PLC的交集靶點進行處理,通過Cytoscape 3.9.1軟件構建QZACP-有效成分-交集靶基因的藥物調控網絡圖;QZACP、有效成分及交集靶基因用“節點”表示,“節點”之間的相互連接用“邊”表示。

1.1.5PPI蛋白互作網絡關系圖構建 通過String網站構建PPI網絡,生物種屬選擇“homo sapiens”,設置網絡參數“medium con fidence”>0.400,同時去除游離無連接的節點,其他參數的設置保持默認,繪制得到PPI網絡[7]。在PPI網絡中,利用節點的大小及顏色深淺凸顯Degree值大小,邊的粗細情況則反映了組合分數(combine score)的大小。通過CytoNCA插件對核心聚類蛋白進行分析得到核心作用靶點。

Tab 1 Related databases and application software

1.1.6GO功能及KEGG通路富集分析 借助DAVID平臺對交集基因進行GO功能富集分析和KEGG通路富集處理,以P<0.001為篩選條件進行關鍵靶基因的GO功能富集分析。根據P值排除寬泛通路后,篩選出前20者使用R 4.1.1軟件進行可視化,另外通過KEGG通路分析得到通路圖。

1.1.7分子對接 利用分子對接研究QZACP的關鍵成分與核心靶點,首先在PubChem 數據庫獲取化合物的2D結構,并通過Chem3D優化為3D結構,進行能量最小化處理后保存為mol2格式。在PDB數據庫下載核心靶點的pdb格式,利用pymol軟件去水處理。通過AutoDock-Vina軟件對分子對接獲得結合能,最后Pymol進行可視化處理。

1.2 體內實驗驗證

1.2.1材料與試劑 人肝癌細胞Huh-7購自廣州速研生物科技有限公司。雄性BALB/c裸鼠,4-6周齡,購于廣東省醫學實驗動物中心;一般飼養,恒溫(23±2) ℃,濕度在40%～60%,照明晝夜交替,自由飲水與進食。QZACP(黃芪20 g、炒白術15 g、柴胡10 g、白芍10 g、薏苡仁30 g、淮山15 g、雞內金10 g、莪術10 g、白花蛇舌草10 g、炙甘草5 g)中藥材由深圳市中醫院提供。EGFR(GB111504)購買于Servicebio生物技術公司;AKT1(A5023)購買于selleck公司;STAT3(ab68153)、山羊抗兔IgG H&L(ab6721)購買于Abcam公司。本實驗經中科產業控股(深圳)有限公司動物福利倫理委員會批準,批準號:20220070。

1.2.2動物模型構建及給藥 將裸鼠隨機分為模型組和QZACP組,每組4只。收獲對數生長期的人肝癌細胞Huh-7,使用PBS將細胞懸液濃度調整為1×1010L-1,于每只裸鼠右側腋窩皮下注射125 uL細胞懸液。于造模后第2天灌胃給藥,根據人與鼠藥物劑量換算公式算出小鼠每日給藥劑量,QZACP組每日按21.2 g·kg-1灌胃,模型組每日給相同劑量的生理鹽水灌胃[8]。于第8天開始隔天用游標卡尺測量皮下瘤的長和寬,使用公式:體積=長×寬2×0.5,計算腫瘤的體積,繪制腫瘤生長曲線。于造模第20天,用異氟烷吸入麻醉,留皮下瘤組織用于進一步檢測。

1.2.3HE染色 取出腫瘤組織,4%多聚甲醛固定組織48 h左右,梯度乙醇及二甲苯脫水,每步15～20 min,石蠟包埋備用。切片后用HE進行染色、封片,在顯微鏡下觀察組織病理學改變。

1.2.4蛋白印跡法測定細胞內相關蛋白的表達 利用RIPA裂解液提取組織蛋白,BCA法測定蛋白濃度并計算,使用SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉移到PVDF膜上,轉膜成功后,在5%脫脂牛奶中封閉1 h后,與STAT3(1 ∶1 000)、EGFR(1 ∶1 000)、AKT1(1 ∶1 000)抗體在4 ℃搖床中孵育過夜,次日TBST洗膜3次后,與二抗(1 ∶2 000,羊抗兔)室溫下孵育1 h,檢測到的蛋白質用使用超敏ECL發光溶液顯影后分析。

2 結果

2.1 QZACP成分及靶點篩選通過TCMSP數據庫搜索QZACP的相關藥物的所有化學成分,共得到184個活性化合物。在TCMSP數據庫未查到雞內金,然后利用BATMAN-TCM數據庫檢索雞內金活性成分7個,并通過BATMAN-TCM補充莪術成分6個。刪除重復成分后共獲得QZACP活性化合物177個,通過SwissTarget數據庫檢索得到上述成分的的靶點,刪去重復值后得到關鍵靶點有625個。

2.2 PLC靶點及藥物可能作用的靶點通過OMIM、drugbank、GeneCards3個數據庫獲得8 227個,刪除重復值后得到452個。將疾病基因與藥物靶點作Venn圖,得到共有靶點98個,見Fig 1。

Fig 1 Venn diagram of drug-disease target intersection

2.3 中藥-活性成分-靶點-疾病網絡關系構建利用Cytoscape3.6.1,將QZACP篩選得到的625個交集靶點、相關活性成分以及PLC的靶點構建"中藥 -活性成分 -靶點 -疾病"網絡圖。并通過Analyze network計算獲得相關節點的度值(Degree)、中心性(Betweenness centrality),度值越大則表示該化合物發揮治療作用的可能越大。Analyze network分析顯示關鍵活性成分主要為Quercetin(槲皮素)、3,22-dihydroxy-11-oxo-delta(12)-oleanene-27-alpha-methoxycarbonyl-29-oic acid(甘草酸苷)、Denudatin B(白玉蘭素B)等(Tab 2)。

Tab 2 The potential active ingredients of QZACP

2.4 PPI蛋白互作網絡圖構建將獲得的數據錄入String數據庫中進行蛋白互作,然后用Cytoscape 3.9.1進行分析獲得Degree值,見Fig 2。平均degree值為44.7,圖中degree值越大則顏色越深點越大。并利用CytoNCA插件對關鍵蛋白進行分析,以Betweenness、Closeness、Degree等3個值為篩選條件,經過兩次篩選獲得10個核心基因作用網絡,見Fig 3。

Fig 2 Network diagram of potential target

2.5 GO富集分析和KEGG通路富集分析通過DAVID進行GO富集分析共得到861個分析條目,其中生物過程有681條,細胞組成有59條,分子功能有121條。分析前20的GO條目發現,QZACP治療PLC可能對信號轉導、基因表達的正向調控、凋亡過程的負調控、細胞增殖的正調節、轉錄的正調控等生物過程密切相關;分子功能集中在ATP結合、酶結合、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白質結合等方面;細胞組分有胞核、胞質基質等(Fig 4)。KEGG富集分析篩選到162相關通路,主要與癌癥通路、PI3K/Akt通路、MAPK通路、腫瘤中的微小RNA、人乳頭瘤病毒感染等密切相關,見Fig 4。根據中藥-成分-靶點圖、PPI蛋白互作、KEGG通路富集結果,選擇STAT3、EGFR、AKT1為接下來對接預測的關鍵蛋白。

2.6 分子對接Quercetin(槲皮素)、3,22-dihydroxy-11-oxo-delta(12)-oleanene-27-alpha-methoxycarbonyl-29-oic acid(甘草酸苷)、Denudatin B(白玉蘭素B)與STAT3、EGFR、AKT1等關鍵蛋白進行了9次分子對接(Tab 3),結果顯示關鍵靶點與成分化合物均有較好的結合能。Quercetin是健脾藥物共有的活性成分,STAT3與Quercetin的結合能力較強。3,22-dihydroxy-11-oxo-delta(12)-oleanene-27-alpha-methoxycarbonyl-29-oic acid(甘草酸苷)與STAT3、EGFR、AKT等靶點均有較好的結合能力及穩定性。通過Pymol軟件將分子對接結果進行優化如Fig 5可知Quercetin與STAT3中的LYS-344、GLU-331、THR-341這3個氨基酸有較強的氫鍵作用。3,22-dihydroxy-11-oxo-delta(12)-oleanene-27-alpha-methoxycarbonyl-29-oic acid與AKT1中的GLN-113、TRP-80、SER-56這3個氨基酸有較強的氫鍵作用。說明槲皮素與甘草酸苷對QZACP藥效發揮作用有重要影響,為研究QZACP對PLC的作用機制提供了理論參考。

Fig 3 Core gene screening

Fig 4 Visual analysis diagram of biological process,cell composition,molecular function and KEGG

2.7 動物實驗經20 d治療后,模型組、QZACP組腫瘤質量分別為(1.16±0.19) g、(0.57±0.07) g,與模型組相比,QZACP組腫瘤質量明顯降低(P<0.01)(Fig 6A)。模型組、QZACP組腫瘤體積分別為(1.2±0.4) cm3、(0.3±0.1) cm3,與模型組對比,QZACP組腫瘤體積明顯減小(P<0.05)(Fig 6B、C)。此外,經QZACP處理后,與模型組相比,原位移植瘤中的STAT3、EGFR、AKT1等蛋白的表達均明顯降低(Fig 6D)。HE染色后顯微鏡下可見原位移植瘤的面積也隨QZACP劑量增加逐漸減少 (Fig 6E),QZACP組腫瘤細胞減少,細胞形態較為完整(紅色箭頭處);模型組腫瘤細胞較多,細胞核明顯增大,核仁明顯,肝板排列紊亂,血管較多(紅色箭頭處)。

Fig 5 Molecular docking diagram

Fig 6 In vivo test

3 討論

本課題組成員在前期研究中多角度闡述了QZACP對PLC的調控。通過回顧性研究發現,中藥QZACP聯合TACE較單純TACE可以提高BCLC B期和C期HCC患者的KPS評分,提高1年、3年、5年的生存率,表明QZACP聯合TACE可提高BCLC B期和C期HCC患者的生活質量,并延長其存活時間[5]。實驗研究發現,QZACP通過調控肝癌上皮間質化來延緩肝癌進展[6]。

本研究通過分析發現,槲皮素、甘草酸苷、白玉蘭素B可能是QZACP治療PLC的關鍵成分化合物。其中在黃芪、白花蛇舌草、柴胡、炙甘草等中均含有槲皮素,該活性成分在該方中含量較高,結合關鍵靶點較多,抗癌作用較為明顯(Tab 2)。槲皮素可以促進乳腺癌細胞發生凋亡[9]。此外,鄭巖松等[10]發現,槲皮素能夠通過降低SMMC-7721細胞遷移及侵襲活性,增加E-cadherin表達,降低N-cadherin和Vimentin蛋白,阻止或緩解肝癌細胞發生上皮間質轉化。甘草酸苷可以特異性地與半聚體PGRMC1結合,抑制了PGRMC1和EGFR之間的相互作用,從而抑制了癌癥進展所需的EGFR介導的信號傳導,另外其可以明顯增強了EGFR抑制劑厄洛替尼或順鉑(CDDP)誘導的人結腸癌HCT116細胞的死亡[11]。PAF是一種血小板活化因子,可以明顯增強了乳腺癌細胞遷移和乳腺癌介導的破骨細胞的生成,白玉蘭素可以作為天然PAF拮抗劑可通過部分阻斷PAF/PTAFR信號通路而有效減弱乳腺癌的進展[12]。白玉蘭素B是白玉蘭素的異構體,但目前在腫瘤方面的研究仍然有限。該方治療PLC的關鍵靶點有STAT3、EGFR、AKT1等,在癌癥中EGFR常見的下游信號轉導通路為PI3K/Akt、MAPK信號通路[13],而AKT為PI3K/Akt信號通路的核心。AKT又稱為蛋白激酶B(PKB),是在如葡萄糖代謝、凋亡、細胞增殖轉錄及細胞遷移等多種細胞過程中起到重要作用的一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶,有研究表明AKT通路是IL-8誘導癌細胞遷移、侵襲和轉移的主要下游信號通路[14],Sun等[15]研究發現,敲除IL-8 降低了整合素β3、p-PI3K和p-Akt的水平,減弱了肝細胞癌細胞侵襲力。轉錄激活因子(STAT3)是調節抗腫瘤免疫反應的核心,NF-κB信號傳導是炎癥引起的致癌和抗腫瘤免疫的重要信號通路,而STAT3與NF-κB之間的相互作用促進了腫瘤進展[16]。

Tab 3 Docking and binding of compounds in QZACP with target

通過KEGG富集分析發現,PI3K/Akt是芪術PI3K/Akt信號通路圖譜抗癌方治療PLC可能的關鍵通路(Tab 4,Fig 7)。Zhao等[17]研究表明,FGFR3與表皮生長因子受體(EGFR)共表達,FGFR3 通過促進 EGFR 磷酸化來激活PI3K/Akt信號的傳導,以促進卵巢癌的順鉑耐藥性。Ma等[18]發現,CD73產生的腺苷與腺苷A2A受體(A2AR)結合并激活Rap1,后者可以將P110β招募到質膜并觸發PIP3的產生,從而激活PI3K/Akt信號通路,以促進肝細胞癌的上皮-間質轉化、轉移及進展。這提示了調控PI3K/Akt信號通路可能是抑制PLC侵襲擴散的緣由所在。總之,PI3K/Akt信號通路可能是QZACP治療PLC的關鍵。

分子對接結果顯示,QZACP的關鍵化合物與STAT3、EGFR、AKT1等蛋白靶點匹配良好,并通過了動物實驗進行了進一步探索,初步證明了QZACP的藥效機制。根據PPI蛋白互作及KEGG通路富集結果,PI3K/Akt通路可通過介導STAT3、EGFR等上游因素來影響肝癌的生物學功能。但是槲皮素、甘草酸苷等活性成分單體通過PI3K/AKt信號通過對肝癌影響的研究目前尚有限,下一步研究中可進一步驗證槲皮素、甘草酸苷等通過PI3K/AKt信號通路來影響肝癌的發生發展。

Fig 7 Map of PI3K/Akt signaling pathway

Tab 4 Signaling pathway of QZACP in treating PLC

綜上所述,QZACP治療PLC以“扶正抗癌”為基本治療原則,具有益氣活血等作用,具體的藥效機制可能與PI3K/Akt信號通路有關。隨著現代化科技進步,網絡藥理學通過各大平臺數據庫、生物信息學預測等對中藥復方進行現代化闡述,為后續團隊實驗驗證提供了方向,并具有較好的創新性。中藥及活性單體多靶點、多途徑的優勢對于臨床診療具有一定的意義,但其具體機制有待團隊進一步驗證與挖掘。