HDACs及其抑制劑對急性肺損傷調控作用的研究進展

賴 凱,高明朗,李 寧,耿 慶

(武漢大學人民醫院胸外科, 湖北 武漢 430060)

急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征(acute lung injury/acute respiratory distress syndrome,ALI/ARDS)是由各種肺內肺外致病因素導致的高致死率和病殘率的肺部疾病。其病理表現為雙肺彌漫性非心源性水腫和炎性細胞彌漫浸潤形成,臨床表現為呼吸窘迫和進行性低氧血癥。盡管ALI/ARDS支持治療方式多種多樣,但目前臨床上尚缺乏有效治療ALI/ARDS的策略。因此,進一步探討ALI/ARDS的發病機制有助于發現新的有效的治療靶點。

表觀遺傳修飾在生理和病理環境下對相關基因的調節可直接影響疾病的發生發展過程。組蛋白乙酰化是一種重要的、可逆的表觀遺傳調控方式,其可調節基因在染色質上的可及性和開放程度,從而影響基因的表達。研究表明組蛋白N端的氨基酸乙酰化修飾的動態平衡是由兩種功能相反的酶類介導的,即組蛋白乙酰基轉移酶(histone acetyltransferases,HATs)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDACs)。HDACs通過去乙酰化特定基因位點結合的組蛋白抑制基因轉錄,同時也可通過非去乙酰化酶活性促進相關基因轉錄[1]。有研究表明,HDACs可通過發揮非組蛋白的去乙酰化修飾功能影響ALI的發生發展過程[2]。現就HDACs的家族成員和HDACs抑制劑,以及其在ALI/ARDS中的相關研究進行綜述,總結HDACs調控ALI/ARDS的作用及相關機制。

1 HDACs家族成員和HDACs抑制劑簡要概述

HDACs是一類蛋白酶,可催化組蛋白和非組蛋白(如轉錄因子、激素受體、信號蛋白、伴侶蛋白和DNA損傷反應蛋白)N端賴氨酸殘基上的乙酰基的去除,對染色體的結構修飾和基因表達調控發揮著重要的作用。目前已發現18種人類HDACs(Tab 1),根據其與酵母同源特點分為4大類:I類與酵母去乙酰化酶Rpd3相似,包括HDAC1、2、3、8,具有組織普遍表達特點,HDAC1、HDAC2、HDAC8主要分布于細胞核,HDAC3具有出胞核和入胞核的氨基酸序列,其可在胞核和胞質中穿梭;Ⅱ類與酵母去乙酰化酶Hda1同源,具有組織特異性表達特點,分為HDAC4-7、9、10,其可進一步分為Ⅱa(HDAC4,5,7,9)和Ⅱb(HDAC6,10)兩個亞類,HDAC5和HDAC9主要表達于肌肉、心臟和大腦,HDAC4在大腦和骨骼生長板中高度表達,HDAC7在內皮細胞和胸腺細胞中表達,HDAC6主要在睪丸中表達,HDAC10在肝臟、脾臟和腎臟中表達,Ⅱ類在胞質和胞核中均有分布;Ⅲ類與酵母去乙酰化酶Sir2同源,包括SIRT1-7,其在胞質、胞核、線粒體中均有分布,具有組織普遍表達特點;Ⅳ類為HDAC11,分布于胞核和胞質,主要表達于腎臟、心臟、大腦、骨骼肌和睪丸。從結構上看,I、Ⅱ、IV類HDAC為Zn2+依賴型,而Ⅲ類SIRT為NAD+依賴型。從作用方式上看,目前研究表明在經典的Zn2+依賴型的HDACs中,少數擁有組蛋白去乙酰化酶作用,HDAC1、2、3、6是研究最多的。而對其他的經典型HDACs,盡管顯示被募集于乙酰化的組蛋白,但并不具有組蛋白賴氨酸去乙酰化作用。HDAC1、2、3是I類HDACs,常以多蛋白共抑制復合體的形式發揮去乙酰化酶活性,如HDAC1和2在Sin3、NuRD、CoREST、MiDAC和MIER家族等幾個主要的多蛋白共抑制復合體中共同表達[3],而HDAC3是SMRT和NCoR配合物的催化亞基[4]。HDAC6主要定位于細胞質,除了具有組蛋白去乙酰化酶活性,而且能夠去乙酰化胞質中的非組蛋白,研究表明α微管蛋白(α-tubulin)、皮動蛋白(cortactin)、熱休克蛋白90(heat shock protein 90,HSP90)是HDAC6的底物[5]。與經典型HDACs類似,SIRTs-1、2和3在sirtuins家族中具有強大的去乙酰化酶活性;相對而言,SIRT 4、5、6、7的去乙酰化酶活性很弱甚至沒有。

Tab 1 HDACs classification,subcellular localization and representatives of HDACIs

HDACs抑制劑(histone deacetylase inhibitors,HDACIs)是一類化合物,有干擾組蛋白去乙酰化酶活性的功能。目前天然或合成的HDACIs根據其化學結構可大致分為以下幾類,包括羥肟酸衍生物、苯甲酰胺類、脂肪酸、環肽、sirtuins蛋白抑制劑,其各自代表化合物分別為曲古抑菌素A( trichostatin A,TSA)、伏立諾他( vorinostat,suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)、恩替諾特( entinostat,MS-275)、丙戊酸鈉( valproic acid,VPA) 和丁酸鈉( sodium butyrate)、羅米地辛( romidepsin,FK228)、Selisistat( EX-527)[6]。需要注意的是,這些化合物大部分對HDACs具有泛抑制性或類抑制性,而不具備單個HDAC選擇性和特異性。高選擇性的HDACIs將更加準確地揭示HDACs在多種疾病生理病理過程中的復雜作用和臨床應用潛力。

2 HDACs在ALI/ARDS中的調控作用及其機制

ALI/ARDS的病理生理過程十分復雜,具體表現在參與細胞的復雜性,疾病階段性,細胞機制的多樣性等。組蛋白乙酰化是調控組蛋白修飾的重要方式之一,HDACs是參與調控組蛋白乙酰化的“erasers”,與HATs的“writers”功能對應。HDACs的豐富性、HDACs的組蛋白和非組蛋白調節功能的多樣性決定了HDACs對ALI/ARDS病理生理過程調節的復雜性(Tab 2)。目前認為,HDACs可通過參與炎癥反應、改變內皮細胞通透性、調控氧化應激、影響肺泡液清除和組織修復參與ALI的發生發展。

2.1 HDACs調節急性肺損傷炎癥反應炎癥反應是ALI/ARDS的重要原因,HDACs及其抑制劑HDACIs參與免疫和炎癥調控過程[2,7-8]。Toll樣受體(Toll like receptor 4,TLR4)介導的核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路的激活是膿毒癥誘導ALI炎癥產生的重要機制。相關研究表明HDACs對TLR4信號通路的下游NF-κB和MAPK起著重要的調節作用。NF-κB亞單元p65轉錄因子的不同位點的乙酰化對其轉錄能力、DNA結合能力和作用時間至關重要,HDAC 3依賴的NF-κB去乙酰化促進了與抑制蛋白(inhibitor of NF-κB,IκBα)的相互作用,促進NF-κB的核輸出,從而抑制炎癥相關基因的表達[9]。此外,Liu等[10]指出LPS增加HDAC6的活性,促進ɑ微管蛋白的去乙酰化,從而使得IκB磷酸化增加,促進NF-κB的活化,使用HDAC6的選擇性抑制劑CAY10603抑制肺組織炎癥應答和損傷。TLR4介導的MAPK信號通路的活化可被乙酰化的絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶-1(dual specificity protein phosphatase 1,MKP-1)抑制,使用HDACI Compound 9a抑制了HDAC1對MKP-1的去乙酰化,從而抑制炎癥因子的產生,改善肺組織損傷[11]。

除了對Toll樣受體信號通路的調節外,HDACs還參與調控了炎癥介質的表達和分泌。基質金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9,MMP9)是一種炎癥介質,介導基質的降解,其可促進炎癥因子在肺內的擴散和降解肺血管內皮細胞間的連接蛋白,加劇肺水腫。研究顯示,HDAC8選擇性抑制劑WK2-16處理THP-1細胞時并不影響LPS刺激的經典炎癥信號通路,其增加了轉錄因子陰陽1 (Yin and Yang 1 protein,YY1)的乙酰化,后者又募集HDAC1于MMP-9的啟動子,從而抑制MMP-9的表達[12]。高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)是另一種分泌型炎癥介質,Xun Liang等[13]學者發現炎癥介質HMGB-1誘導了嚴重燒傷誘導的ALI的發生,HDAC抑制劑丁酸鈉抑制了HMGB-1表達和分泌過程,從而改善了ALI。此外,研究報道Ⅲ類HDACs成員SIRT1能直接作用于HMGB-1,抑制細胞核內的HMGB-1乙酰化從而抑制其向胞外的分泌[14]。另外,HDAC4也調控HMGB-1的乙酰化。研究發現TLR4介導的下游兩面神激酶(Janus kinase,JAK)-信號傳導及轉錄激活因子1(signal transducers and activators of transcription,STAT1)信號通路的活化促進HDAC4的降解,從而使HMGB-1的乙酰化形式增多促進其分泌[15]。

Tab 2 Effects of HDACs in acute lung injury

大量研究表明,炎癥小體的活化在ALI/ARDS發生發展中扮演著重要的角色。HDACs也參與了對炎癥小體的調節。SIRT1作為一種Ⅲ類HDACs,其去乙酰化活性增強是小鼠內毒素性ALI的內源性保護機制,有研究顯示其通過抑制炎癥小體的活化減輕盲腸結扎穿孔(cecal ligation and puncture,CLP)誘導的肺損傷,同時在Sirt1敲除小鼠中,膿毒癥更易誘發炎性肺損傷[16]。此外,HDAC1對炎癥小體1(NLR family pyrin domain containing 1,NLRP1) 的調節在ALI中也有報道,Chen等[17]在ALI體內外模型中發現HDAC1和羧基末端結合蛋白2(C-terminal binding protein 2,CtBP2)、轉錄因子叉頭框P3(forkhead box P3,FOXP3)形成復合體抑制miR-199a-3p的轉錄,而miR-199a-3p的下調消除了其對NLRP1的抑制,導致NLRP1的激活和胱冬肽酶-1介導的前體IL-1β和前體IL-18的切割。炎癥小體的活化可促進細胞的調節性死亡如細胞焦亡,巨噬細胞焦亡參與ALI/ARDS的病理過程,有研究指出TSA可抑制巨噬細胞焦亡,通過抑制c-Jun氨基末端激酶(c-jun terminal kinase,JNK)-細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)和STAT3-組蛋白去甲基化酶JMJD3通路的激活來實現的[18]。

綜上,HDACs參與調控ALI/ARDS的炎癥通路、炎癥介質的活化和釋放以及炎癥小體活化過程。

2.2 HDACs調節內皮細胞通透性肺微血管內皮細胞通透性增加是ALI/ARDS炎癥導致的病理過程,同時內皮屏障的破壞也是ALI/ARDS的重要加重因素。大量研究表明,HDAC6通過多種不同方式調控肺內皮細胞的通透性[19]。研究人員在LPS誘導的膿毒癥急性肺損傷模型中發現使用Aza和TSA聯合治療通過抑制內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)/ 小窩蛋白(caveolin-1,Cav1)/肌球蛋白輕鏈2(myosin light chain 2,MLC2)信號通路和增強血管內皮鈣粘蛋白VE-cadherin表達減輕LPS誘導的肺內皮細胞通透性增加和減輕肺損傷[20]。Joshi等[21]研究人員發現,Hsp90的去乙酰化是LPS誘導內皮細胞高通透性的重要機制,使用HDAC6的選擇性抑制劑或干擾RNA通過抑制Hsp90的去乙酰化減輕ALI。此外,HDAC6去乙酰化α-微管蛋白和β-連環蛋白,降低了微管穩定性和增加了MLC的磷酸化,誘導內皮細胞收縮和肌動蛋白應力纖維的形成,介導了TNF-α誘導的內皮細胞高通透性和屏障破壞,同時使用HDAC6的干擾RNA和抑制劑減輕了肺水腫的形成[22]。另外,最近研究表明,使用Ⅱa類HDAC抑制劑TMP269通過抑制人肺微血管內皮細胞精氨酸結合蛋白2(Arg/Abl interacting protein 2,ArgBP2)的表達保護內皮屏障功能和減輕ALI也間接說明HDAC6促進內皮屏障的破壞在ALI的病理過程中[23]。HDAC3是I類組蛋白去乙酰化酶,有研究發現HDAC3對內皮細胞的通透性也具有調節作用。與HDAC6作用相反,研究人員使用I類HDAC抑制劑MS-275通過抑制內皮細胞的HDAC3,從而抑制Robo4的表達增加內皮細胞的通透性,表明HDAC3具有內皮屏障保護作用[24]。綜上可知,大量研究集中于HDAC6對內皮完整性的調節作用,研究結果表明主要分布于胞質中的HDAC6參與細胞骨架的等非組蛋白的去乙酰化調控,進而促進病理環境下內皮屏障的破壞,選擇性抑制HDAC6對內皮通透性具有保護作用從而抑制ALI/ARDS的發展。然而,HDAC3對內皮屏障的保護作用需要進一步研究來證實。

2.3 HDACs調節急性肺損傷氧化應激過程活性氧(reactive oxygen species,ROS)是ALI/ARDS的加重因素,可誘導肺組織細胞的死亡,放大肺部炎癥反應。缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)誘導肺組織氧化應激和損傷,HDAC抑制劑VPA上調抗氧化物血紅素加氧酶1(heme oxygenase1,HO-1)的活性抑制I/R效應,鋅原卟啉IX治療可阻斷VPA的保護作用[25]。此外,抗增殖蛋白1(prohibitin1,PHB1)是一種線粒體蛋白,對線粒體呼吸功能有重要作用,在膿毒癥患者和CLP膿毒癥模型中觀察到,HDAC6抑制PHB1的表達和功能,改變線粒體呼吸鏈的功能從而增加氧化劑的產生,增加氧化應激,進而導致多個器官嚴重的氧化損傷,使用HDAC6抑制劑抑制線粒體功能障礙和減少氧化產物減輕CLP誘導的膿毒癥,從而保護大鼠免受氧化損傷[26]。這些研究顯示HDAC6可能在ALI發生發展過程中發揮促氧化應激作用。此外,線粒體自噬通過清除損傷的線粒體抑制細胞氧化應激反應,叉頭框轉錄因子O亞型3(forkhead box O3,FOXO3)是調節自噬的相關因子,研究表明,SIRT3通過去乙酰化FOXO3促進線粒體自噬減輕膿毒癥小鼠的氧化應激和炎癥反應[27]。

2.4 HDACs調控肺泡液清除和組織修復肺泡水腫液的清除和肺組織的修復是ALI/ARDS患者后期的生理過程。肺泡上皮細胞Na+/K+-ATP酶介導的肺泡液體轉運是肺泡水腫液體清除的重要機制,轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)在ALI/ARDS后期的纖維化中起重要的作用。研究顯示TGF-β誘導HDAC2磷酸化促進其活性,下調Na+/K+-ATP酶亞單元ATP1B1的表達,抑制肺泡液Na+的排出,HDAC抑制劑TSA促進ATP1B1的表達,從而促進肺泡液的清除[28]。另外,上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在急性肺損傷的后期即組織修復過程中扮演了促纖維化的角色,Li等[29]發現HDAC4介導的蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)信號通路參與了肺泡上皮細胞EMT過程,HDAC抑制劑TSA降低HDAC4的活性,抑制肺組織修復纖維化的過程。上述研究表明HDACs參與了ALI/ARDS后期肺組織修復過程,HDACs對肺組織修復的進一步研究有助于改善患者的預后。

3 臨床應用

目前HDACs調控肺正常生理功能的研究較少,但不可否認HDACs對肺生理的調節作用,有研究表明,HDAC3是胚胎發育和出生后維持肺部巨噬細胞穩態所必需的[30]。因此,在臨床實際應用HDACs靶向藥物時需考慮其是否會影響肺正常生理功能。迄今為止,體內實驗表明,HDACIs具有良好的耐受性和較少的不良反應,有學者猜想HDACIs對HDACs活性的不完全和暫時性抑制以及并未干擾抑制復合體可能對體內研究結果進行合理解釋。此外,在以HDACs為靶點藥物進行肺癌臨床試驗的研究中,HDACIs并未顯示肺部相關并發癥,如呼吸困難等。高選擇性HDACs靶向藥物的開發,基礎研究對HDACs生理功能的揭示以及臨床研究制定合理有效的給藥方案將極大減低HDACs靶向藥物的副作用和提高其有效性。

4 總結與展望

HDACs參與調控ALI/ARDS病理生理過程,包括炎癥反應、內皮細胞通透性、氧化應激、肺泡液清除和肺組織修復等。與此同時,以HDACs為靶向的抑制劑不斷發展,選擇性的不斷提高,促進了HDACs在生理作用的研究,同時也為HDACIs在臨床上使用進行有效地臨床前評估。然而,盡管開展有HDACIs對癌癥臨床研究,目前HDACs在ALI/ARDS中的研究主要來自體外實驗和動物模型,缺乏臨床樣本和試驗數據HDACs研究的局限性。綜上,完善HDACs在ALI/ARDS病理生理過程的作用和相關機制將為ALI/ARDS的藥物治療提供新的干預靶點。