CypD介導mPTP在褪黑素改善七氟醚重復暴露致認知損傷中的作用

鄒雪竹,張曉媛,張 麗

(1. 安徽醫科大學第二附屬醫院麻醉與圍術期醫學科,2. 麻醉與圍術期醫學安徽普通高校重點實驗室,安徽 合肥 230601)

在美國食品藥品監督管理局(FDA)發布的一份有關藥物安全建議的聲明中提到:對于3歲以下嬰幼兒或孕婦來說,在外科手術或其他醫療方式中長期使用全身麻醉藥會增加大腦發育受損的風險[1]。臨床也進行了很多相關性的研究,其中一項回顧性病例分析發現,兒童在幼齡期多次或長時間接受全身麻醉會造成大腦結構的改變和認知功能的缺陷,增加日后發生學習障礙的風險[2]。七氟醚具有無創、血流動力學穩定、術后蘇醒快等獨特的優勢,已成為小兒手術中最常使用的吸入性麻醉劑[3]。同時,七氟醚對發育中大腦的損傷作用也引起了大家的關注。越來越多的基礎實驗研究表明,大腦在發育時期重復或長時間暴露七氟醚會對神經發育產生影響,并且在成年后可能出現認知功能障礙[2]。Zhang等[4]研究發現,七氟醚可以通過上調幼鼠海馬組織中親環素D(cyclophilin D,CypD)的表達,引起線粒體功能障礙和神經損傷,最終造成小鼠的認知功能損傷。

近年的臨床研究發現,褪黑素可能具有抗炎、抗氧化、抗凋亡等多種作用,并且被證實可以在各種病理狀態下發揮神經保護作用。例如,褪黑素被用于緩解新生兒和兒童靜脈穿刺鎮痛的同時,可以減少或代替其他鎮靜劑的用量;其還可作為兒科患者麻醉誘導前的輔助用藥[5]。動物實驗也證明了褪黑素預處理可以通過介導MT-1受體和Wnt信號之間的相互作用,對幼齡小鼠暴露七氟醚后引起的突觸毒性、髓鞘異常和記憶損傷產生積極的影響[6]。然而,褪黑素是否可以通過下調CypD介導線粒體通透性轉化孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的開放,進而減輕神經元突觸損傷及改善認知功能障礙,尚不清楚。因此,本實驗以此為切入點,探索褪黑素改善七氟醚引起發育期神經損傷的可能機制。

1 材料

1.1 實驗動物8周齡C57BL/6J SPF級小鼠(♀9只,♂6只),購自河南斯克貝斯生物科技有限公司,生產合格證書編號:SCXK(豫)2020-0005。小鼠飼養于安徽醫科大學第二附屬醫院實驗動物中心,溫度保持在(24±1)℃,濕度為45%～55%,可自由獲取充足的食物和水。新生小鼠在此實驗動物中心進行繁殖,動物實驗已經實驗動物倫理委員會批準,倫理號:LLSC20221125。

1.2 主要試劑七氟醚(22090931),購自上海恒瑞醫藥有限公司;組織線粒體分離試劑盒(C3606)、JC-1膜電位檢測試劑盒(C2006),均購自北京碧云天生物科技有限公司;動物蛋白提取試劑盒(C510003),購自生工生物工程(上海)有限公司;Omni-EasyTM一步法PAGE快速凝膠制備試劑盒(PG212)、Omni-FlashTM無冰浴快速轉膜液(PS201S)、無蛋白快速封閉液(PS108),均購自上海雅酶生物醫藥科技有限公司;褪黑素(M5250)、Synapsin-1(#3050)抗體,購自美國Sigma-Aldrich公司;抗CypD(ab110324)、PSD95(ab76115)抗體,購自Abcam公司;GAPDH(6004-1-Ig)抗體,購自武漢Proteintech公司。

1.3 主要儀器Varios Ran LUX型多功能微孔板酶標儀(美國賽默飛世爾科技有限公司);543OR型低溫高速離心機(德國艾本德生命科學公司);UVP型凝膠成像儀(德國Analytik Jena公司);七氟醚揮發罐(德國德爾格公司);氣體濃度監測儀(深圳邁瑞生物醫療電子有限公司);Vert.A1型熒光倒置顯微鏡(德國蔡司公司);Morris水迷宮(淮北正華生物儀器設備有限公司)。

2 方法

2.1 模型構建及實驗分組6日齡小鼠隨機分為3組,每組11只:①對照組(Con)每日腹腔注射1%乙醇0.5 h后,吸入30%氧氣混合70%空氣2 h;②七氟醚組(Sevo)每日腹腔注射1%乙醇0.5 h后,吸入3%七氟醚(由30%氧氣和70%空氣的混合氣代入)2 h;③褪黑素預處理+七氟醚組(Sevo+Mel)腹腔注射褪黑素(溶解于無水乙醇,10 mg·kg-1)0.5 h后,吸入3%七氟醚2 h;連續3 d。暴露七氟醚過程中進行濃度監測,并且使用保溫墊保溫,以免小鼠在麻醉狀態下體溫過低,降低死亡率。9只小鼠在實驗結束(8日齡)麻醉后斷頭分離海馬組織,用于提取線粒體;24只小鼠在第30～40日齡時進行行為學實驗,實驗結束后分離小鼠海馬,提取蛋白質。

2.2 線粒體膜電位檢測小鼠在8日齡造模結束后直接斷頭取腦,在冰上分離海馬組織,按重量在研磨管中加入線粒體分離試劑A,冰浴研磨,將勻漿高速離心2次,去除上清液,分離得到的沉淀即為線粒體,再將線粒體儲存液加入到線粒體中重懸。使用線粒體膜電位檢測盒中提供的試劑進行JC-1染色工作液的配制,將0.9 mL稀釋后的JC-1染色工作液與0.1 mL未經冷凍的線粒體重懸液加入到6孔板中,混勻,馬上在倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照,熒光強度使用ImageJ軟件分析。

2.3 新物體識別實驗用于評估動物對新奇事物的學習和記憶能力,實驗用箱大小為40 cm×40 cm×40 cm。造模小鼠在第30日齡時進行實驗,分為3個階段:①適應階段,將小鼠放置在沒有任何物體的箱子內5 min,以適應實驗環境,每天2次,連續適應3 d;②熟悉階段,將兩個相同的物體(F1和F2)放置在箱子中離側壁10 cm的位置,從物體的反方向放入小鼠,讓其自由運動10 min熟悉物體,并記錄在箱內的移動軌跡;③測試階段,熟悉階段結束后24 h,用1個新的物體(N)替代其中1個物體(F2),并讓小鼠在實驗箱內自由探索5 min,記錄運動軌跡。每次測試結束后,使用75%乙醇清除味道以免對小鼠產生干擾。使用動物行為分析軟件(Smart 3.0)記錄小鼠分別對新物體和舊物體的探索時間,按照嗅探新物體時間與總時間的比值計算新物體識別指數。

2.4 Morris水迷宮主要用于分析動物的空間記憶能力。泳池直徑為80 cm,被平均分為4個象限,平臺放置于任一象限,水位線位于平臺上方約1 cm處。小鼠在第35日齡時進行實驗,首先為練習階段,將小鼠分別從泳池的4個象限放入,將小鼠尋找平臺的時間稱為逃逸潛伏期,如果60 s內未發現目標,則引導至平臺處,此時逃逸潛伏期為60 s,每天訓練4次,連續5 d。24 h后,進行實驗階段,取出平臺,在平臺所在象限的對面象限放入小鼠,記錄小鼠在60 s內穿越平臺所在象限的次數及平臺所在象限內的運動時間和路程[7]。

2.5 蛋白質印跡行為學實驗完成后的d 2,小鼠在麻醉狀態下斷頭取腦,于冰上分離海馬組織,將配好的蛋白裂解液(包含蛋白酶抑制劑)加入到組織中,60 Hz研磨45 s,將勻漿在冰上靜置10 min后,高速離心機4 ℃離心,獲得的上清液即為總蛋白,使用BCA法檢測蛋白濃度。再將蛋白與上樣緩沖液充分混合,變性,保存于-20 ℃。取蛋白樣品置于冰上,用一步法快速凝膠進行電泳分離,按所需目的蛋白的分子量大小進行轉膜,使用快速封閉液封閉15 min,TBST洗滌后,加入1 ∶1 000稀釋的一抗(CypD、Synapsin-1、PSD95)4 ℃搖床孵育過夜。一抗孵育結束后,與相同種屬來源的二抗在室溫孵育1 h,使用凝膠成像儀化學發光法進行條帶顯影,ImageJ軟件分析條帶灰度值。

3 結果

3.1 褪黑素對七氟醚引起的學習記憶障礙的改善作用新物體識別實驗結果表明(Fig 1),與對照組相比,七氟醚組小鼠的記憶能力下降,未認出熟悉物體,花費更多時間探索舊物體,較少時間探索新物體,新物體識別指數明顯下降(P<0.01);而褪黑素預處理組的小鼠對熟悉物體具有一定的記憶,偏好新奇性的天性使小鼠對新物體更感興趣,探索時間明顯增加,對熟悉物體探索時間減少,新物體識別指數升高,證明褪黑素對學習記憶能力具有改善作用(P<0.01)。

3.2 褪黑素對七氟醚引起的空間記憶障礙的改善作用Morris水迷宮實驗結果顯示(Fig 2),與對照組相比,七氟醚組小鼠的逃逸潛伏期明顯延長,而在平臺所在象限內穿越平臺次數、運動時間和路程均明顯下降(P<0.05);與七氟醚組相比,褪黑素預處理組的小鼠在訓練第3天時,逃逸潛伏期開始下降,在第4天和第5天時下降更明顯,同時小鼠穿越平臺次數、在平臺所在象限內運動的時間和距離均明顯增加。

3.3 褪黑素升高海馬神經元線粒體膜電位如Fig 3所示,與對照組比較,七氟醚組小鼠海馬神經元線粒體中,JC-1聚合物與JC-1單體熒光比值降低(P<0.01),說明線粒體膜電位下降;與七氟醚組比較,褪黑素預處理組的線粒體膜電位明顯升高(P<0.01)。

3.4 褪黑素及七氟醚對突觸蛋白、CypD表達的影響如Fig 4所示,與對照組相比,七氟醚組Synapsin-1、PSD95突觸蛋白表達下降(P<0.01),CypD表達上調(P<0.05);與七氟醚組相比,褪黑素預處理組Synapsin-1、PSD95突觸蛋白表達均上調(P<0.05),CypD表達下降(P<0.01)。

Fig 2 Morris water n=8)

4 討論

七氟醚作為兒童全身麻醉中最常見的吸入麻醉藥,已被證實,在嬰幼兒時期大量使用會影響神經發育及以后的認知功能[8]。人類神經系統發育關鍵期是妊娠晚期和嬰兒期,對于嚙齒類動物來說,神經發育關鍵期是出生后2周內,因此,麻醉劑的干擾在這個時間段表現最為顯著和持久[9]。美國麻醉臨床結果登記處(NACOR)數據庫顯示,臨床上大多數兒童麻醉時間低于3 h,但對于病情較重的患兒,麻醉時間可能會大于3 h[10]。3%的濃度是兒科手術中最常用到的七氟醚濃度[11],因此我們模擬了臨床上常用的七氟醚濃度,增加暴露時間和次數建立模型。

褪黑素作為氧化和凋亡信號的內源性調節劑,具有神經保護作用,能夠維持線粒體穩態。研究發現,褪黑素可以通過受體依賴性途徑改變Ca2+/CaMKⅡ活性,加速受損神經元的細胞骨架重塑[12]。褪黑素也能通過增加NMDA受體濃度、Ca2+/CaMKⅡ和腦源性神經營養因子蛋白水平,調節鈣穩態,改善記憶和認知缺陷[13]。臨床上,因其具有催眠、鎮痛、抗驚厥等特點,被用于術前鎮靜劑和麻醉劑的結合[14]。鑒于目前所知的褪黑素副作用較少,我們將褪黑素用于提高七氟醚麻醉的安全性。

新物體識別實驗是根據動物具有接觸與探索新鮮事物的喜好,用于檢測其學習記憶能力;Morris水迷宮可以很好地反映動物在空間方面的記憶和學習能力;兩種方法的結合可以客觀評價小鼠的學習和記憶能力[15]。為了觀察褪黑素對七氟醚損傷遠期認知功能的改善作用,我們進行了新物體識別和Morris水迷宮實驗。行為學實驗結果顯示,小鼠在幼年時期接受大量七氟醚暴露,在其成年后會出現新物體和空間學習記憶障礙,經褪黑素預處理的幼鼠,其成年后在新物體識別及空間記憶功能中并沒有表現出明顯異常,可以認為褪黑素在一定程度上有助于預防或治療七氟醚暴露所引起的小鼠的認知缺陷。

Fig 3 Detection of mitochondrial membrane n=3)

線粒體在促進神經發育過程中起到關鍵作用,在突觸形成的關鍵時期暴露全身麻醉劑將會導致線粒體融合和有絲分裂的失衡,產生過多的氧自由基,引起突觸的能量代謝紊亂,對突觸功能造成損害[4]。其中,CypD介導的mPTP的開放對線粒體功能具有重要調節作用。七氟醚暴露可以使小鼠海馬組織中CypD的表達升高,線粒體膜電位降低,而線粒體膜電位的下降可以直接反映mPTP的開放程度[16]。本實驗發現,七氟醚麻醉會導致幼齡小鼠突觸蛋白表達下降及CypD表達上調,線粒體膜電位降低,說明七氟醚暴露加速了線粒體膜電位的下降,誘導了mPTP開放,損傷線粒體功能,造成神經元的凋亡。褪黑素的應用下調了CypD的表達,提高了線粒體膜電位水平,證明褪黑素可以抑制CypD,提高線粒體膜電位水平,緩解mPTP的過度開放,保護線粒體功能。

Fig 4 Expression of CypD, PSD95 and Synapsin-1

PSD95和Synapsin-1作為突觸后和突觸前標志物,大量研究表明其參與了突觸可塑性,降低突觸相關蛋白的表達可以誘導突觸損傷[17]。其中,Synapsin-1更是神經元突觸發育的典型標志物[18]。本實驗發現,褪黑素預處理抑制了七氟醚引起的PSD95和Synapsin-1表達的減少,表明褪黑素的使用有助于改善七氟醚引起的海馬突觸發育障礙。

綜上所述,褪黑素預處理可以改善新生動物重復暴露七氟醚后導致神經元突觸損傷及認知障礙,其機制與抑制CypD的表達和mPTP的開放,促進突觸蛋白的合成相關。本研究將為探索兒童麻醉和手術后認知功能障礙的潛在機制和有針對性的干預提供理論支持。