白藜蘆醇通過EGFR/AKT/mTOR通路改善結直腸癌細胞伊立替康化療耐藥性

王 麗,龐 靜,沈 慧,寇茜睿,王玉玨,張 靜,李 芳

(1.延安大學醫學院基礎醫學院, 2. 延安大學附屬醫院內分泌代謝科,陜西 延安 716000)

結直腸癌(colorectal cancer,CRC)是臨床上常見的一種消化系統惡性腫瘤,是腫瘤相關死亡的主要原因之一[1]。晚期CRC一線化療藥物—伊立替康可通過結合DNA單鏈斷裂位點上的DNA拓撲異構酶Ⅰ,形成伊立替康—DNA拓撲異構酶Ⅰ—DNA復合物,進而使DNA單鏈斷裂轉變為雙鏈斷裂來抑制DNA復制,從而發揮抑制腫瘤的作用[2]。但部分CRC患者會出現獲得性耐藥,最終影響伊立替康的化療效果[3]。因此,深入探究IRI的耐藥機制并改善其化療耐藥性是目前CRC臨床治療亟待解決的關鍵問題之一。

白藜蘆醇(resveratrol,RES)是一種天然的植物抗毒素,廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等多種植物中;其不僅具有抗氧化和抗炎作用,還具有良好的抗腫瘤活性,在腫瘤的發生、進展及轉移等階段均有一定的化學預防作用[4-5]。如RES可通過調節糖代謝重編程,在肝癌的癌前階段抑制二乙基亞硝胺誘導的大鼠肝細胞過度增殖[6]。RES可誘導CRC細胞凋亡,并抑制CRC細胞的上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)進程和干細胞樣轉變,從而在CRC的發生發展過程中發揮抑癌作用[7]。此外,RES還被證實能夠通過PI3K/AKT/mTOR通路逆轉卵巢癌細胞對順鉑的化療耐藥性[8]。但目前鮮有關于RES在CRC細胞IRI化療耐藥性調控中的作用及其分子機制的相關報道。另一方面,EGFR/AKT/mTOR信號通路在腫瘤進展和放化療耐受性調控等方面扮演重要角色[9-11]。如CD109可通過激活EGFR/AKT/mTOR信號通路促進肺癌的轉移和化療耐藥[10]。TBMS1可部分通過抑制EGFR誘導的PI3K/AKT/mTOR/NF-κB信號通路活化來提高替莫唑胺耐藥膠質母細胞瘤細胞的化療敏感性[11]。但RES能否通過下調EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細胞的IRI化療耐藥性目前尚未見報道。

本研究以CRC細胞系HT-29和RKO為研究對象,通過MTT實驗、克隆形成實驗及劃痕實驗等探究分析RES在CRC細胞增殖、遷移及IRI化療耐藥性方面的調控作用,并進一步闡明RES通過下調EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細胞IRI化療耐藥性的相關分子機制。這對于提高CRC患者的化療效果并延長其生存期具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑RES購自源葉生物(B20044);伊立替康購自Selleck(S5026);EGFR激活劑NSC 228155購自MCE(HY-101084);AKT激活劑SC79購自Selleck(S7863);AKT抑制劑MK2206購自碧云天(SF2712);MTT試劑購自索萊寶(M8180)。MMP2、MMP9、EGFR、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR等抗體均購自Proteintech,貨號分別為:10373-2-AP、10375-2-AP、51071-2-AP、66444-1-Ig、60203-2-Ig、67778-1-Ig、66888-1-Ig;β-actin抗體購自全式金生物(HC201-02)。

1.2 細胞培養所用細胞均來自延安大學醫學研究實驗中心細胞庫。人CRC細胞系HT-29和RKO細胞分別用含10%胎牛血清的5A培養液與DMEM培養液培養于37 ℃、5% CO2的培養箱中。除特殊說明外,均選取對數生長期的CRC細胞用于后續實驗。除特殊說明外,藥物處理濃度如下:HT-29細胞RES處理濃度為80 μmol·L-1,IRI處理濃度為10 μmol·L-1;而RKO細胞RES處理濃度為40 μmol·L-1,IRI處理濃度為2.5 μmol·L-1;且NSC 228155、SC79、MK2206的藥物處理濃度分別為2 μmol·L-1、10 μmol·L-1和2 μmol·L-1。

1.3 MTT實驗將細胞接種于96孔板中(HT-29細胞:3×103個/孔,RKO細胞:2.5×103個/孔),24 h后分別加入不同濃度的藥物,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。分別于24 h、48 h、72 h時加入MTT試劑(20 μL/孔),37 ℃孵育4 h,酶標儀檢測490 nm處A值,并計算細胞的存活率。

1.4 克隆形成實驗藥物處理48h后,將細胞以1×103個/孔的密度接種于12孔板中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養7-10 d。接著用PBS沖洗細胞2次,4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結晶紫染色30 min,沖洗、干燥并拍照。用500 μL DMSO溶解后,酶標儀檢測570 nm處A值。

1.5 劃痕實驗將細胞接種于6孔板中,培養至細胞密度80%～90%時,用10 μL移液器槍尖垂直劃線;PBS沖洗2次后,更換為含藥的1%胎牛血清培養基,記為0 h,拍照。藥物處理細胞24 h和48 h后,更換為新鮮含藥的1%胎牛血清培養基,拍照,計算細胞遷移率。

1.6 Western blot藥物作用48h后,用RIPA裂解液提取CRC細胞總蛋白,BCA蛋白定量,取20 μg進行電泳、轉膜和封閉等。一抗4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育1.5 h,加入ECL發光液曝光顯影。

2 結果

2.1 RES可改善CRC細胞的IRI化療耐藥性為探究RES與IRI對CRC細胞增殖的影響,分別用不同濃度梯度的RES和IRI處理人CRC細胞HT-29(RES:0、80、120、160、200、240 μmol·L-1;IRI:0、10、20、30、40、50 μmol·L-1)與RKO(RES:0、40、80、120、160、200 μmol·L-1;IRI:0、2.5、5、10、20、40 μmol·L-1),采用MTT法檢測分析CRC細胞的增殖能力。結果如Fig 1A-D所示,RES和IRI均可明顯抑制HT-29和RKO細胞增殖,且呈時間與劑量依賴性。經GraphPad Prism 8軟件計算,RES作用于HT-29和RKO細胞的48 h半數抑制濃度(IC50)分別為130.9 μmol·L-1和78.98 μmol·L-1,IRI作用于HT-29和RKO細胞的48 h半數抑制濃度(IC50)分別為28.88 μmol·L-1和10.12 μmol·L-1。根據量效曲線,選取起效濃度RES 80 μmol·L-1聯合IRI 10 μmol·L-1作用于HT-29細胞,RES 40 μmol·L-1聯合IRI 2.5μmol·L-1作用于RKO細胞。MTT與克隆形成實驗結果表明,與對照組(DMSO處理組)相比,RES單藥處理組、IRI單藥處理組、RES與IRI聯合處理組的CRC細胞增殖能力均明顯降低,且RES與IRI聯合處理組的細胞增殖能力明顯低于IRI單藥處理組,提示RES可明顯增強IRI對CRC細胞能力的抑制作用(Fig 1E-G)。

接下來,通過劃痕實驗檢測分析了RES、IRI及這兩者聯合對CRC細胞遷移的影響。與對照組相比,RES單藥處理組、IRI單藥處理組及RES與IRI聯合處理組CRC細胞的遷移能力均明顯降低;且RES與IRI聯合處理組CRC細胞的遷移能力明顯低于IRI單藥處理組(Fig 2A,B)。與此一致,Western blot結果表明,與對照組相比,RES單藥處理組、IRI單藥處理組及RES與IRI聯合處理組CRC細胞中遷移標志分子MMP2及MMP9的蛋白表達水平均明顯降低;且RES與IRI聯合處理組CRC細胞中這兩種蛋白的表達水平均明顯低于IRI單藥處理組(Fig 2C,D)。這些實驗結果表明,RES可明顯增強IRI對CRC遷移的抑制作用。綜上可得,RES能夠改善CRC細胞的IRI化療耐藥性。

Fig 1 RES combined with IRI inhibited proliferation of CRC

Fig 2 RES combined with IRI inhibited migration of CRC

2.2 RES通過EGFR/AKT/mTOR信號通路改善CRC細胞IRI化療耐藥性鑒于EGFR/AKT/mTOR信號通路在腫瘤化療耐藥中的重要作用,通過Western blot探究分析RES是否通過下調EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細胞IRI化療耐藥性。結果表明,相比于對照組,RES單藥處理組、IRI單藥處理組及RES與IRI聯合處理組CRC細胞中EGFR、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表達水平均明顯降低;且這些蛋白在RES與IRI聯合處理組CRC細胞中的表達水平均明顯低于IRI單藥處理組(Fig 3A,B)。這些研究結果提示,RES可能通過下調EGFR/AKT/mTOR信號通路來抑制CRC細胞增殖和遷移,進而改善其IRI化療耐藥性。

2.3 NSC 228155和SC79均可逆轉RES對CRC細胞IRI化療耐藥性的改善作用用EGFR激活劑(NSC 228155)、AKT激活劑(SC79)及AKT抑制劑(MK2206)進一步驗證RES是否通過下調EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細胞的IRI化療耐藥性。這里共分為5個處理組:DMSO組、RES+IRI組、RES+IRI+NSC 228155組、RES+IRI+SC79組、RES+IRI+NSC 228155+MK2206組。結果發現RES+IRI+NSC 228155組與RES+IRI+SC79組CRC細胞的增殖和遷移能力均明顯高于RES+IRI組,而RES+IRI+NSC 228155+MK2206組CRC細胞的增殖和遷移能力均明顯低于RES+IRI+NSC 228155組(Fig 4A-C)。以上研究結果表明,NSC 228155與SC79均可逆轉RES對IRI化療耐藥性的改善作用,而MK2206能夠部分逆轉NSC 228155的這種作用。

3 討論

RES作為一種廣泛存在于葡萄、虎杖、花生等多種植物中的天然有機化合物,除具有很好的抗炎、抗氧化作用,還被證實具有良好的抗腫瘤活性[4-5]。有研究表明,RES能夠以濃度依賴的方式來抑制CRC細胞HCT116 與SW480的增殖和集落形成[12]。與此一致,本研究發現RES可明顯抑制CRC細胞HT-29和RKO的增殖、遷移,表明其在CRC中具有良好的抗腫瘤活性。除抗腫瘤活性外,RES可能在腫瘤化療耐藥中也發揮了重要調控作用。據報道,RES不僅能夠逆轉甲狀腺未分化癌對多西他賽/阿霉素的繼發性耐藥,還可通過降低ADAM9的蛋白表達水平來抑制食管鱗狀細胞癌和肺癌細胞的遷移,且RES與達沙替尼、5-FU等臨床化療藥物聯用具有良好的協同抗癌作用[13- 14]。但目前鮮有關于RES在CRC細胞IRI化療耐藥中的調控作用及其分子機制的相關報道。本研究發現,相比于IRI單藥處理組,RES與IRI聯合處理組CRC細胞的增殖和遷移能力明顯降低,即RES可增強IRI對CRC細胞增殖和遷移的抑制作用。提示:RES能夠改善CRC細胞的IRI化療耐藥性,在CRC的臨床治療中具有很好的應用前景。

Fig 3 RES ameliorated IRI chemoresistance of CRC cells through EGFR/AKT/mTOR

Fig 4 Both NSC 228155 and SC79 reversed ameliorating effect of RES on IRI chemoresistance of CRC

EGFR為受體酪氨酸激酶ErbB家族成員之一,其可通過激活下游AKT/mTOR信號通路參與調控腫瘤發生發展過程中的多個環節,包括細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、血管生成及自噬等[15]。眾多研究證據表明,EGFR/AKT/mTOR信號通路激活在腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲及其放化療抗性中發揮關鍵調控作用[9]。但EGFR/AKT/mTOR信號通路在CRC細胞IRI化療耐藥性中的調控作用相關研究報道較少。研究表明,相比于非靶向脂質體,運載IRI的EGFR靶向脂質體在體內外表現出更好的抗腫瘤活性[16]。IRI處理可使CRC細胞中MSH2蛋白表達水平上調,反過來,MSH2表達上調又能夠減弱CRC細胞的CPT-11敏感性,而AKT信號通路已被發現可調節這一過程[17]。與此一致,本研究結果表明,RES可通過下調EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細胞的IRI化療耐藥性。即與IRI單藥處理組相比,RES與IRI聯合處理組CRC細胞中EGFR、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表達水平均明顯降低,提示EGFR/AKT/mTOR信號通路轉導受到抑制。有趣的是,本研究發現,RES不僅能下調AKT和mTOR的磷酸化水平,還能夠降低AKT及mTOR的總蛋白表達水平,從而抑制CRC細胞增殖遷移并改善其IRI化療耐藥性。這與姜黃素等其他藥物通過下調AKT和mTOR的磷酸化水平來發揮腫瘤抑制作用有所不同[18]。這些研究證據提示,RES通過EGFR/AKT/mTOR信號通路調控CRC細胞IRI化療耐藥性的分子調控網絡機制可能比我們設想的更為復雜,接下來我們將對此展開更為深入的研究。而EGFR激活劑(NSC 228155)與AKT激活劑(SC79)均可逆轉RES對CRC細胞IRI化療耐藥性的改善作用,反之AKT抑制劑(MK2206)能夠部分逆轉EGFR激活劑的這種作用。這些研究結果表明,RES至少部分通過下調EGFR/AKT/mTOR信號通路來改善CRC細胞的IRI化療耐藥性。

綜上,RES可能通過下調EGFR/AKT/mTOR信號通路來抑制CRC細胞增殖和遷移,進而改善CRC細胞的IRI化療耐藥性。這為RES與IRI聯合治療CRC提供了堅實的理論基礎,對于CRC患者化療效果的改善及其生存期的延長具有重要意義。