八角蓮醇提物抑制MAPK信號通路引起腎癌細胞凋亡的作用機制

游贛花,何 戀,李 凱,楊 萌,文 周,劉旺培,朱建國

(1.貴州省第二人民醫院科研科/藥劑科,貴州 貴陽 550002;2.貴陽學院生物與環境工程學院,貴州 貴陽 550005;3.遵義醫科大學研究生院,貴州 遵義 563000;4.韶關市食品藥品檢驗所化學室,廣東 韶關 521028;5.貴州省人民醫院泌尿外科,貴州 貴陽 550000)

腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)在全球惡性腫瘤中排名第16位,占成人癌癥的3%,占死亡人數的2%[1]。據估計,2020年,全球有43.1萬例腎癌新發病例和17.9萬例死亡病例[2]。2016年,WHO根據其形態、分子和遺傳特征對腎癌進行了分類,最常見的亞型是腎透明細胞癌。在臨床診療過程中,約30%的RCC患者在診斷時有轉移,且由于RCC對傳統的放化療不敏感,30%～70%的RCC患者在手術治療后仍有可能復發[3]。因此,必須更好地了解RCC的發病和進展相關機制,以尋找治療這種惡性腫瘤的新策略。

活性氧(Reactive oxygen species,ROS)是一類壽命短且反應性高的小分子[4]。研究顯示,低劑量ROS水平與細胞存活機制有關,例如增殖、分化和細胞周期進程[5],而細胞內ROS水平升高會引起線粒體DNA鏈斷裂和DNA降解,導致細胞凋亡[6]。因此,調節異常ROS水平、細胞增殖和凋亡是治療癌癥的重要干預措施。

本研究旨在探討八角蓮(Dysosmaversipellis)醇提物是否可以誘發ROS積累調節MAPK信號通路,并進一步調節腎透明細胞癌OS-RC-2細胞增殖、凋亡,為開發具有潛在抗RCC作用的新藥提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑八角蓮購自貴州省貴陽市中藥材市場,并經貴州省食品藥品檢驗所中藥室熊慧林主任藥師鑒定為小檗科鬼臼屬植物八角蓮Dysosmaversipellis的根莖。胎牛血清(以色列BI,批號:2351431);0.25%胰酶消化液(美國Gibco,批號:2428760);RPMI 1640 培養液(美國Gibco,批號:8122551);細胞活力檢測試劑盒(日本同仁,批號:SX748);ROS分析試劑盒(江蘇凱基,批號:20220621);流式凋亡試劑盒(美侖生物,批號:MA0220-1);流式周期試劑盒(聯科生物,批號:A10431);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海索萊寶,批號:20220225);JNK、ERK、P-ERK、p38、β-actin抗體(武漢三鷹,批號分別為:10023911、00115457、00116961、1004552、00095479);caspase-9、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2抗體(美國CST,批號分別為:9508S、20750S、2772S、15071S);超敏化學發光試劑(美國Affinity,批號:1927b02)。

1.2 主要儀器CO2細胞培養箱(日本SANYO);顯微鏡成像系統(日本Olympus);流式細胞儀(美國Beckman);酶標儀(美國Bio-teck);電泳槽和轉膜儀(北京六一);化學發光成像系統(美國SYNGENE)。

1.3 數據庫與軟件TCMSP數據庫(https://old.tcmsp-e.com/index.php);Swiss target數據庫(https://swisstargetprediction.ch);Genecards數據庫(https://www.genecards.org/);Venny2.1網站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/);DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp);string數據庫(https://cn.string-db.org/);Cytoscape3.5.1軟件。

1.4 方法

1.4.1藥物的提取 取適量八角蓮干藥材粉碎后70%乙醇浸泡2 h,并回流提取3次,每次1 h,合并提取液,過濾,70 ℃水浴濃縮成干浸膏。稱取干浸膏100 mg,加DMSO充分溶解,并加細胞培養液定容至10 mL,0.22 μm小濾器過濾,制備成母液(10 g·L-1)備用。臨用前加細胞培養液稀釋至所需濃度給藥(加入細胞中的藥物DMSO終濃度<0.2%)。

1.4.2細胞的培養 OS-RC-2腎透明細胞癌細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司,并經STR鑒定。快速從液氮罐中取出細胞凍存管經37 ℃水浴,再加入5～10倍體積的RPMI 1640完全培養液低速離心5 min后棄上清液,加入1 mL 10%培養液重懸細胞后,加培養液至4 mL,置于37 ℃含5% CO2培養箱內,24 h后更換新培養液。

1.4.3細胞活力(cell counting kit,CCK-8)檢測 按3×103個/孔將OS-RC-2細胞接種于96孔板,待細胞貼壁后進行給藥處理,每組分別設6個復孔,并設置2個調零孔,繼續培養24、48、72、96 h,然后加入10 μL CCK-8在37 ℃下孵育2 h,用酶標儀在450 nm處測量吸光度值。

1.4.4克隆形成實驗 將細胞消化成單懸浮液,按1.5×103個/孔接種于6孔板,待細胞貼壁后進行給藥處理,繼續培養14 d,PBS洗2遍,4%多聚甲醛固定30 min,棄去固定液,臺盼藍染色30 min,后用流水緩緩洗去染色液,晾干后拍照。

1.4.5劃痕實驗 將2孔劃痕插件與6孔板緊密粘連,接種OS-RC-2細胞,待細胞完全鋪滿兩孔插件底部時,用鑷子輕輕取出兩孔插件;分別加入不同濃度的藥物,24 h后100倍顯微鏡下拍照,相對遷移面積=(0 h空白面積-24 h空白面積)/0 h的空白面積×100%。

1.4.6Transwell實驗 用無血清培養基重懸細胞,調整細胞密度為5×108·L-1。24孔板下室加入600 μL含20%胎牛血清的培養基,并取100 μL含/不含八角蓮藥物的細胞懸液加入Transwell小室,常規培養24 h。取出Transwell小室,棄去孔中培養液,PBS洗2遍,多聚甲醛固定30 min,棄去固定液,0.1%結晶紫染色30 min,后用流水緩緩洗去染色液,晾干后100倍顯微鏡下拍照。

1.4.7ROS水平檢測 按1×106個/孔將細胞接種于6孔板,按照不同分組分別對相應的孔進行處理,放置于37 ℃、5% CO2培養箱內培養24 h。向孔中加入DCFH-DA使終濃度為10 μmol·L-1,吹打混勻后放入培養箱內避光孵育。流式細胞儀上機檢測,使用488 nm激發波長,525 nm發射波長,各組細胞的平均熒光強度反映了細胞內的ROS水平。

1.4.8八角蓮活性成分及潛在作用靶點的獲取 利用TCMSP數據庫獲取八角蓮化學成分,Swiss target數據庫獲取八角蓮對應的作用靶點。利用Genecards數據庫,以“ROS”為關鍵詞進行檢索,以種屬為“Homo(智人)”,相關性“>1”為篩選標準,找到ROS的相關靶基因。利用venny2.1分析八角蓮和ROS的共同靶點。利用DAVID數據庫對以上共同靶點進行KEGG和GO富集分析。用Cytoscape3.5.1軟件展示八角蓮-成分-靶點的關系,并利用string數據庫對所得共同基因進行PPI分析。

1.4.9流式細胞凋亡檢測 取對數生長期的細胞,按1×109·L-1接種于6孔板內,進行所需的處理(加藥或不加藥),24 h后終止培養。收集細胞,加入400 μL 1×Binding Buffer輕輕重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻,室溫避光孵育15 min,加入10 μL PI染色液,輕輕混勻,冰浴避光放置5 min,在30 min內進行流式細胞術檢測。

1.4.10流式細胞周期檢測 取對數生長期的細胞,按1×109·L-1接種于6孔板內,進行所需的處理(加藥或不加藥),24 h后終止培養。1 000 r·min-1離心5 min,收集細胞沉淀,棄上清,用預冷PBS洗滌2次,加入預冷75%乙醇,于4 ℃固定4 h。1 500 r·min-1離心5 min,棄上清,PBS洗滌1次,加入400 μL的PI染液,100 μL的RNase A,4 ℃避光孵育30 min,上機檢測。

1.4.11Western blot蛋白表達檢測 提取細胞總蛋白,按30 μg/孔進行蛋白上樣,再進行SDS-PAGE,濕法轉膜將蛋白條帶轉移至PVDF膜。將膜置牛奶封閉液中室溫下搖床封閉2 h;加入JNK、ERK、P-ERK、caspase-9、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2、p38一抗工作液置4 ℃冰箱過夜;TBST 緩沖液(pH=7.4)洗膜,室溫下孵育稀釋的二抗1.5 h;TBST洗膜,ECL發光液顯影。同法封閉、孵育β-actin。ImageJ軟件對條帶進行灰度分析。

2 結果

2.1 八角蓮給藥對OS-RC-2細胞增殖、遷移能力及ROS水平的改變首先,將八角蓮醇提物分別用不同濃度給藥后檢測細胞活力。CCK-8 結果顯示,相較于對照組,八角蓮給藥后可明顯抑制OS-RC-2的細胞活力,且呈濃度及時間依賴性抑制細胞活力,見Fig 1A。將八角蓮采用4、8、12 mg·L-13個濃度給藥,并檢測給藥后細胞克隆形成的變化。結果顯示,與DMSO對照組相比,3個濃度的八角蓮給藥后均可明顯降低OS-RC-2細胞的克隆形成能力,且呈濃度依賴性降低細胞克隆形成數(P<0.01),見Fig 1B。

我們用劃痕實驗及Transwell實驗檢測八角蓮對OS-RC-2細胞遷移能力的影響。結果顯示,八角蓮給藥可明顯抑制OS-RC-2細胞的遷移能力(P<0.01),見Fig 1C,D。

接下來,我們進一步用4、12 mg·L-1兩個濃度的八角蓮給藥后檢測細胞ROS水平變化。結果顯示,與DMSO對照組相比,八角蓮給藥后細胞ROS水平明顯升高(P<0.01),見Fig 1E。

2.2 八角蓮活性成分及作用靶點的尋找為探索八角蓮抑制OS-RC-2細胞增殖的分子機制,我們利用網絡藥理學尋找八角蓮成份和靶點的關系。首先,利用TCMSP數據庫獲取八角蓮的化學成分,用Swisstarget數據庫獲取八角蓮的對應靶點,利用Genecards數據庫獲取ROS的相關靶點,并通過venny 2.1取交集得到八角蓮-ROS的共同靶點,找到165個共同靶點,見Fig 2A。用Cytoscape3.5.1軟件展示八角蓮-成分-靶點的關系,Swisspredict數據庫中,可能性大于0.5的靶點被展示(Fig 2B);利用DAVID數據庫對以上165個基因進行KEGG(Fig 2C)和GO通路富集分析(Fig 2D),KEGG分析發現MAPK信號通路有明顯的變化。

2.3 蛋白質相互作用網絡(PPI)構建及核心靶點篩選對以上165個共同靶點進行映射后所得交集靶點導入string數據庫中進行檢索,獲取靶點相互作用的網絡關系數據,繪制PPI網絡圖,共獲得165個節點和511條蛋白網絡互作關系,見Fig 3。

2.4 八角蓮給藥對MAPK信號通路關鍵蛋白表達水平的改變KEGG分析發現MAPK信號通路變化明顯,故我們進一步用Western blot實驗進行了信號通路關鍵蛋白JNK、ERK及p-ERK蛋白表達水平的檢測。結果顯示,八角蓮給藥48 h后,可明顯降低JNK蛋白水平及p-ERK/ERK比值(P<0.05,P<0.01),見Fig 4A-C,提示八角蓮可抑制MAPK信號通路關鍵蛋白表達。

2.5 八角蓮給藥對細胞凋亡水平的改變研究顯示八角蓮給藥能通過Wnt信號通路抑制細胞活力和侵襲能力,促進食管癌細胞凋亡[7],故我們進一步進行了細胞凋亡及周期的相關檢測。流式細胞術結果顯示,將八角蓮給藥48 h后,可明顯促進細胞凋亡(P<0.01),見Fig 5A;可減少G1期細胞量,并明顯升高G2/M期細胞量,見Fig 5B;Western blot結果顯示,八角蓮給藥后可降低caspase-9及Bcl-2蛋白表達水平,而升高cleaved caspase-9及Bax蛋白表達水平(P<0.05,P<0.01),見Fig 5C。以上結果表明八角蓮給藥可促進OS-RC-2細胞凋亡水平。

2.6 NAC給藥對細胞增殖、凋亡及ROS水平的改變因用“八角蓮”和“ROS”取交集后的共同靶點進行KEGG分析發現MAPK信號通路有變化,且文獻報道[8-9] MAPK信號通路與細胞凋亡有關,故我們猜想,八角蓮是否通過刺激ROS積累引起MAPK信號通路變化促進細胞凋亡這種機制來發揮抗腫瘤作用。接下來,我們用ROS抑制劑NAC進行了驗證。實驗分為:DMSO對照組、八角蓮給藥組、NAC(3 mmol·L-1)給藥組、八角蓮+NAC聯合給藥回復實驗組。結果顯示,NAC與八角蓮聯合給藥48 h時可明顯逆轉八角蓮單獨給藥對OS-RC-2的細胞活力(P<0.01,見Fig 6A)及凋亡(P<0.01,見Fig 6B)作用;此外,NAC與八角蓮聯合給藥組可明顯逆轉八角蓮單獨給藥對細胞凋亡關鍵蛋白caspase-9、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2的表達變化,及MAPK信號通路蛋白ERK、p38蛋白的表達改變(P<0.05,P<0.01),見Fig 6C。上述結果表明,八角蓮可能是通過ROS積累發揮抑制OS-RC-2細胞的增殖及促進凋亡作用,以及發揮抑制MAPK信號通路的作用。

Fig 2 The active ingredients and target map of Dysosma versipellis

Fig 3 Network diagram of common target in OS-RC-2 cells inhibited by Dysosma versipellis

Fig 4 Effect of Dysosma versipellis on protein level of MAPK signaling

3 討論

八角蓮為小檗科八角蓮屬植物八角蓮的根莖,主要為木脂素類、黃酮類、醌類等成分[10],具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等多種藥理作用[11-12]。研究顯示,八角蓮提取物可抑制前列腺癌及膠質母細胞瘤細胞的增殖[13-14],但八角蓮在RCC中的作用及其機制尚不清楚。

本課題用不同濃度的八角蓮醇提物進行了增殖及遷移能力檢測,初步驗證了其對OS-RC-2細胞增殖、遷移能力的抑制作用。ROS水平檢測顯示八角蓮能明顯升高OS-RC-2細胞的ROS水平,研究顯示細胞內ROS水平升高會引起線粒體DNA鏈斷裂和DNA降解,導致細胞凋亡[6]。為探索八角蓮升高OS-RC-2細胞ROS水平的作用機制,我們利用網絡藥理學進行八角蓮成份和作用靶點的尋找,并通過維恩分析取交集,共得到165個八角蓮-ROS的共同靶點。進一步對以上165個基因進行KEGG和GO通路富集分析,發現MAPK信號通路有明顯的變化。

Fig 6 Effect of NAC on cell viability,apoptosis rate and ROS of OS-RC-2

MAPK由ERK1/2、MEK1/2和p38組成[15],可被多種細胞外刺激激活。MAPK途徑的激活可導致多種生理效應,包括凋亡、細胞增殖、有絲分裂等[16]。研究表明,MAPK/ERK信號通路的激活可促進多種類型腫瘤細胞的增殖、遷移,并抑制腫瘤細胞凋亡。例如,益氣解毒方水提物通過抑制MAPK/ERK信號通路關鍵蛋白表達發揮促進鼻咽癌細胞凋亡的作用[17]。LncRNA DICER1-AS1通過靶向miR-650激活MAPK/ERK信號通路促進結直腸癌進展[18]。然而,八角蓮是否影響RCC中的MAPK/ERK途徑還有待明確。

我們進一步用八角蓮給藥,Western blot對MAPK信號通路關鍵蛋白及凋亡相關蛋白進行檢測。結果顯示,八角蓮給藥后,明顯降低JNK、caspase-9、Bcl-2、p-ERK/ERK蛋白表達水平,而升高cleaved caspase-9、Bax蛋白表達水平。上述結果提示八角蓮給藥可能抑制MAPK/ERK信號通路,并促進細胞凋亡水平。

接下來,我們用ROS抑制劑NAC進行回復實驗,檢測OS-RC-2細胞增殖、凋亡及MAPK信號通路蛋白表達的變化。結果顯示,NAC與八角蓮聯合給藥可明顯逆轉八角蓮單獨給藥對OS-RC-2的細胞活力及凋亡作用,并可明顯逆轉八角蓮單獨給藥對細胞凋亡關鍵蛋白caspase-9、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2的表達變化,及MAPK信號通路蛋白ERK、p38蛋白的表達改變,提示:八角蓮可能通過促進ROS水平變化發揮抑制MAPK信號通路,促凋亡及增殖抑制作用。

綜上所述,八角蓮可能通過促進ROS水平變化抑制MAPK信號通路,從而發揮對腎透明細胞癌OS-RC-2細胞的促凋亡及增殖抑制作用,此研究有望為開發具有潛在抗RCC作用的新藥提供理論基礎。