黃芩苷調節let-7i-3p/PI3K/Akt/NF-κB信號軸減輕類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞NLRP3炎性小體活化

張 煒,王 莉,楊雨欣,馬 銳,王 麗,黃 菱,萬巧鳳

(1. 寧夏醫科大學基礎醫學院病原生物學與醫學免疫學系,寧夏 銀川 750004;2. 寧夏醫科大學總醫院風濕科,寧夏 銀川 750003;3. 寧夏醫科大學臨床醫學院,寧夏 銀川 750004)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是自身免疫性疾病,嚴重時會引起全身關節腫脹疼痛及損壞,甚至殘障[1]。在RA的病理進展中,涉及多種免疫細胞間的相互作用,其中人成纖維樣滑膜細胞(human fibroblast like synoviocytes of rheumatoid arthritis,HFLS-RA)的NLRP3炎性小體異常激活發揮重要作用[2]。所以,研究NLRP3炎性小體異常活化的影響因素及開發治療RA的新藥意義重大。

NLRP3炎性小體屬于固有免疫組分,由NLRP3、凋亡斑點樣蛋白(ASC)及半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(caspase-1)組成。ASC通過與caspase-1前體結合而激活caspase-1,進而促進IL-1β、IL-18分泌,直接影響RA的炎癥狀態[3]。當前治療RA主要策略是抑制NLRP3炎性小體的活化[4]。前期研究表明,黃芩苷具有良好的緩解HFLS-RA分泌炎性細胞因子[5]、減輕膠原誘導型關節炎大鼠關節病變的作用[6]。有關黃芩苷抗RA作用機制亟待深入闡明。本研究以HFLS-RA為研究對象,探究黃芩苷是否具有減輕NLRP3炎性小體活化的作用及其可能機制,為黃芩苷臨床治療RA提供更堅實的理論基礎。

1 材料

1.1 細胞株HFLS-RA(貨號:C1195),購自上海冠導生物工程有限公司;293T細胞(貨號:CL0005),購自豐暉生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑黃芩苷(純度98%),購自蘭州沃特萊斯生物科技有限公司。let-7i-3p NC、let-7i-3p mimics、let-7i-3p inhibitor、let-7i-3p inhibitor NC,由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成;TRIzol(貨號:15596-026)、RT-qPCR擴增試劑盒(貨號:AM1200),均購自Invitrogen公司;M-MLV反轉錄試劑盒(貨號:RR036A),購自TaKaRa公司;一抗PI3K p110α(貨號:AG2867)、p-Akt(Ser473,貨號:AF5740)、NLRP3(貨號:AF2155)、ASC/TMS1(貨號:AF6234)、caspase-1(貨號:AF1681),均購自上海碧云天生物技術有限公司;NF-κB p65抗體(貨號:4764),購自美國Cell Signaling Technology公司;GAPDH一抗(貨號:60004-1-Ig)、FITC標記山羊抗兔IgG(貨號:SA00003-2),均購自武漢三鷹生物技術有限公司;HRP標記山羊抗兔IgG二抗(貨號:ZB-2301),購自北京中杉金橋生物技術有限公司;人IL-1β(貨號:RX106152H)、IL-18(貨號:RX106154H)ELISA試劑盒,均購自睿信生物科技有限公司。

1.3 儀器PCR儀(qTOWER3G,德國耶拿分析儀器有限公司);Westen blot電泳儀(DYY-300B,北京東方瑞利電泳設備有限公司);Westen blot多功能成像系統(SH-523,杭州申花科技有限公司);熒光顯微鏡(DMI3000+DFC310FX,德國徠卡公司)。

2 方法

2.1 細胞培養采用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養HFLS-RA,傳代3～4次后,進行后續實驗。

2.2 黃芩苷對NLRP3炎性小體活化的影響

2.2.1免疫熒光檢測各組細胞NLRP3的熒光強度 本實驗共設4組,分別為對照組、黃芩苷(25、50、100 mg·L-1)干預組,每組3個復孔。HFLS-RA以2×104個/孔接種于鋪有細胞爬片的24孔板,培養24 h。黃芩苷干預48 h后取出爬片,采用4%多聚甲醛固定細胞15 min;采用0.25% Triton X-100處理10 min;滴加山羊血清37 ℃封閉30 min,滴加NLRP3抗體37 ℃孵育1 h;滴加FITC熒光二抗,避光孵育30 min;最后滴加DAPI封片,采用熒光顯微鏡觀察并拍照。

2.2.2Western blot檢測p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表達 實驗分組同“2.2.1”。將HFLS-RA以6×105個/皿接種至直徑35 mm的培養皿,細胞貼壁后,加黃芩苷干預48 h,提取各組細胞總蛋白,BCA法蛋白定量。SDS-PAGE電泳及轉膜,5%脫脂牛奶封閉后,分別加入對應一抗4 ℃孵育過夜;TBST漂洗液洗膜3次,每次10 min;加入HRP標記的二抗,37 ℃孵育1 h;加入ECL發光液,經X線曝光、顯影、定影。最后采用Image-Pro Plus軟件對目的條帶進行灰度分析,各目的條帶與GAPDH的灰度比值為目的蛋白的相對表達量。

2.2.3ELISA檢測細胞上清中炎癥因子的含量 按照IL-1β、IL-18試劑盒說明書,測定各組細胞上清中IL-1β、IL-18的含量。

2.3 黃芩苷抑制NLRP3炎性小體活化的機制研究

2.3.1雙熒光素酶報告實驗驗證let-7i-3p靶向作用PIK3CA 采用生物信息學TargetScan 7.0軟件分析,發現PIK3CA是let-7i-3p的靶標之一。為了進一步驗證PIK3CA與let-7i-3p的靶向對應關系,本實驗構建了熒光素酶報告質粒野生型3’-UTR(GV272-WT-PIK3CA-3’-UTR)、突變型3’-UTR(GV272-MUT-PIK3CA-3’-UTR)和let-7i-3p表達質粒(GV251-let-7i-3p)。本實驗共設6組:實驗組1(let-7i-3p-NC+3’-UTR-NC)、實驗組2(let-7i-3p+3’-UTR-NC)、實驗組3(let-7i-3p-NC+3’-UTR-WT)、實驗組4(let-7i-3p+3’-UTR-WT)、實驗組5(let-7i-3p-NC+3’-UTR-MUT)、實驗組6(let-7i-3p+3’-UTR-MUT)。使用X-tremegene HP轉染劑共轉染293T細胞,轉染48 h后,檢測螢火蟲熒光素酶和Renilla熒光素酶的活性,在轉染目的質粒時,安排0.5 μg GFP質粒單獨轉染。質粒構建由上海吉凱基因科技有限公司完成。

2.3.2Western blot驗證let-7i-3p靶向作用PIK3CA 本實驗共設4組:let-7i-3p mimics組、let-7i-3p NC組、let-7i-3p inhibitor組、let-7i-3p inhibitor NC組。將HFLS-RA以2×105個/孔接種于直徑35 mm皿中,每組3個復皿。用含10%胎牛血清的DMEM培養液培養,待細胞長至80%～90%時,棄上清,PBS清洗2次,按LipofectamineTM3000轉染說明書,將let-7i-3p mimics、let-7i-3p NC、let-7i-3p inhibitor及let-7i-3p inhibitor NC分別轉染對應組,37 ℃、5% CO2培養箱中培養5 h后,更換新的含有10%胎牛血清的DMEM繼續培養48 h。蛋白提取及Western blot同“2.2.2”。

2.3.3RT-qPCR檢測黃芩苷干預前后let-7i-3p及PIK3CA mRNA表達 本實驗設對照組、100 mg·L-1黃芩苷干預組,每組3個復孔。將HFLS-RA以6×105個/孔接種6孔板。黃芩苷處理48 h后,提取總RNA,紫外分光光度計定量。以3 μg RNA為模板,反轉錄合成cDNA,再以2 μL cDNA為模板擴增。PCR總體積為20 μL,擴增條件:預變性94 ℃、15 min,變性95 ℃、20 s,退火60 ℃、35 s,延伸72 ℃、20 s,共35個循環,72 ℃延伸10 min后,4 ℃終止反應。采用2-ΔΔCT計算基因的相對表達量,GAPDH為PIK3CA內參、U6為miRNA內參。引物由上海生工生物工程有限公司合成,序列見Tab 1。

2.3.4miRNA干擾驗證黃芩苷經調節let-7i-3p/PI3K抑制NLRP3炎性小體的活化 本實驗共設4組:對照組、100 mg·L-1黃芩苷干預組、let-7i-3p inhibitor組、let-7i-3p inhibitor+100 mg·L-1黃芩苷干預組,每組3個復孔。將HFLS-RA以2×104個/孔接種于鋪有細胞爬片的24孔板,培養24 h后,進行miRNA干擾及黃芩苷干預。let-7i-3p inhibitor轉染方式及黃芩苷干預方式分別同“2.3.2”及“2.3.3”。

3 結果

3.1 黃芩苷可抑制NLRP3炎性小體活化

3.1.1黃芩苷對NLRP3炎性小體活化的影響 如Fig 1A所示,與對照組比較,50、100 mg·L-1黃芩苷干預組的NLRP3熒光強度明顯減弱。說明黃芩苷可抑制NLRP3炎性小體的活化。

3.1.2黃芩苷對PI3K/Akt/NF-B/NLRP3信號軸關鍵蛋白表達的影響 如Fig 1B所示,與對照組比較,50、100 mg·L-1黃芩苷處理組的p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表達水平明顯降低。表明黃芩苷的抗炎作用與其下調PI3K/Akt/NF-κB/NLRP3信號軸關鍵蛋白的表達相關。

3.1.3黃芩苷對HFLS-RA分泌IL-1β及IL-18蛋白表達的影響 如Fig 1C所示,與對照組比較,50、100 mg·L-1黃芩苷處理組IL-1β及IL-18的含量明顯降低。說明黃芩苷抑制了IL-1β及IL-18的分泌。

3.2 黃芩苷抑制NLRP3炎性小體活化的機制

3.2.1let-7i-3p與PIK3CA存在靶向對應關系 TargetScan 7.0預測結果顯示,let-7i-3p靶向PIK3CA基因的3’-UTR(Fig 2A)。如Fig 2B所示,質粒轉染體系無異常。與對照組相比,let-7i-3p可以明顯降低野生型質粒的活性,而不影響突變質粒的活性(Fig 2C)。如Fig 2D所示,分別轉染let-7i-3p mimic、let-7i-3p NC、let-7i-3p inhibitor及let-7i-3p inhibitor NC 48 h后,與let-7i-3p NC組相比,let-7i-3p mimic組PIK3CA蛋白的表達明顯降低(P<0.01);與let-7i-3p inhibitor NC組相比,let-7i-3p inhibitor組PIK3CA蛋白的表達明顯升高(P<0.01)。該實驗研究表明,let-7i-3p與PIK3CA存在靶向相對應關系。

3.2.2黃芩苷對HFLS-RA中let-7i-3p及PIK3CA mRNA表達的影響 如Fig 3所示,與對照組比較,黃芩苷干預組let-7i-3p的表達明顯上調(P<0.05),PIK3CA mRNA表達明顯下調(P<0.01)。

3.2.3黃芩苷靶向調節let-7i-3p/PIK3CA軸減輕NLRP3炎性小體的活化 如Fig 4所示,與對照組比較,黃芩苷干預后明顯抑制了NLRP3炎性小體的活化;let-7i-3p inhibitor干擾let-7i-3p后,加強了NLRP3炎性小體的活化;黃芩苷明顯抑制了let-7i-3p inhibitor干擾而增強的NLRP3炎性小體的活化。該實驗進一步表明,黃芩苷經靶向作用let-7i-3p/PIK3CA軸,減輕了NLRP3炎性小體的活化。

4 討論

RA的主要病理特征為病變關節滑膜的增殖及持續分泌高水平促炎細胞因子,導致軟骨損傷和骨侵蝕[7]。HFLS-RA是介導RA關節破壞的主要效應細胞,其NLRP3炎性小體高度活化、分泌炎性介質與PI3K-Akt信號通路的持續激活相關[8]。

PI3K-Akt信號通路可調節炎癥因子的釋放、炎癥相關酶的形成,參與RA的病理過程,在HFLS-RA中廣泛存在,并異常激活[9]。根據結構和特定底物的不同,PI3K被分為Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類,其中研究最多的是Ⅰ類PI3K。哺乳動物表達4種Ⅰ類催化亞基(p110α、β、δ和γ),分別由PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD和PIK3CG基因編碼。P13K被激活并催化細胞第二信使PIP3的形成。反之,PIP3也會招募Akt激酶,激活下游其他分子[10]。Akt是PI3K信號通路的主要介質,位于PI3K信號通路的下游,是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,分為Akt1、Akt2、Akt3三種類型,基中Akt1在人體各種組織中表達[11]。一旦被激活,Akt將磷酸化下游的其他分子,從而激活下游通路[12]。Akt磷酸化活化IκB激酶,導致NF-κB抑制劑IκB的降解,從而使NLRP3炎性小體上游的NF-κB核轉位,促進多種炎癥因子的表達,進而參與炎癥性疾病的發生[13]。

Fig 3 Effect of baicalin on let-7i-3p (A) and

miRNA是在真核生物中一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA,其長度為18～25個核苷酸的非編碼的小分子RNA,可與靶基因的3’-UTR區結合,使靶基因翻譯受到抑制或引起靶基因降解,從而發揮負向調節作用。miRNA的異常表達與許多疾病,如癌癥及RA的發生發展密切相關[14]。有研究表明,miRNA在PI3K信號轉導中發揮重要作用[15]。let-7是目前研究最為廣泛的miRNA之一[16],在多種腫瘤中表達下調[17]。作為let-7家族的一員,let-7i-3p在癌癥中異常表達[18]。

為了探究黃芩苷的抗炎機制,本研究首先采用免疫熒光實驗,發現50、100 mg·L-1的黃芩苷可明顯抑制HFLS-RA中NLRP3炎性小體的活化。機制研究表明,50、100 mg·L-1黃芩苷可明顯抑制HFLS-RA中p-PI3K、p-Akt、NF-κB p65、NLRP3、ASC及caspase-1蛋白表達,表明黃芩苷的抗炎作用與其下調PI3K/AKT/NF-κB/NLRP3信號轉導相關。為了深入探究黃芩苷減輕NLRP3炎性小體活化的分子調控機制,本研究通過miRNA靶向預測軟件Targetscan預測了作用于PI3K的miRNA,發現let-7i-3p是調控PIK3CA亞基的miRNA之一;雙熒光素酶實驗進一步證實了let-7i-3p與PIK3CA存在靶向對應關系;黃芩苷干預實驗表明,黃芩苷上調了HFLS-RA中let-7i-3p的表達、下調了PIK3CA的表達;為了探明黃芩苷與let-7i-3p及NLRP3炎性小體活化三者的關系,進行了let-7i-3p干擾實驗,結果表明,黃芩苷明顯減輕了因let-7i-3p干擾而增強的NLRP3炎性小體的活化。最終結果表明,黃芩苷通過促進let-7i-3p表達、靶向抑制PI3K的PIK3CA亞基的表達,從而減弱了PI3K/Akt/NF-κB信號轉導,最終減輕了NLRP3炎性小體的活化。

Fig 4 Baicalin alleviated NLRP3 by targeting let-7i-3p/PI3K axis(scale bar=20 μm)

綜上,黃芩苷的抗RA作用與其上調let-7i-3p表達,進而靶向抑制PI3K/Akt/NF-κB信號轉導,從而減輕NLRP3炎性小體的活化相關。本研究深化了黃芩苷抗RA的作用機制,為臨床治療RA提供了更為具體的理論依據。