Hippo-YAP通路參與NaAsO2對(duì)PC12細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響

吳 松,顧 丹,張小龍,康文潤(rùn),劉 宇,李 成,王宏健,王東艷,潘際剛

( 貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1.生理學(xué)教研室、2.機(jī)能實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽 550025)

砷是一種在自然界中廣泛存在的非金屬元素,人群常通過水、食物和空氣等途徑接觸砷而導(dǎo)致人體砷中毒[1]。我國(guó)是砷污染較為嚴(yán)重的國(guó)家,其中貴州是我國(guó)一個(gè)典型的燃煤污染型地方性砷中毒病區(qū)[2]。經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查,發(fā)現(xiàn)砷可造成包括心血管系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和皮膚在內(nèi)的許多人體系統(tǒng)和器官的毒性損傷[3]。砷可誘發(fā)中樞和周圍神經(jīng)病變,導(dǎo)致多發(fā)性神經(jīng)炎和神經(jīng)衰弱等疾病[4]。但是,砷引起神經(jīng)損傷的具體機(jī)制至今仍不十分明確。Hippo-YAP信號(hào)通路的核心部分是由3個(gè)激酶組成的級(jí)聯(lián)反應(yīng)構(gòu)成,分別是哺乳動(dòng)物STE20樣蛋白激酶1/2(mammalian STE20-like protein kinase 1/2,MST1/2),大腫瘤抑制因子1/2 (large tumor suppressor 1/2,LATS1/2) 和最終效應(yīng)因子Yes 相關(guān)蛋白(Yes-associated protein,YAP)[5]。此通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、控制細(xì)胞增殖與凋亡方面有重要作用,并且在進(jìn)化上高度保守[6]。本課題組前期研究已經(jīng)證明,NaAsO2能激活Hippo-YAP通路,誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡,促進(jìn)細(xì)胞S期阻滯[7],而且Hippo-YAP通路參與NaAsO2影響PC12細(xì)胞活力、形態(tài)及突觸后致密蛋白95(post synaptic density protein,PSD95)、突觸素蛋白(synaptophysin,SYN)表達(dá)[8]。那么,Hippo-YAP信號(hào)通路是否參與NaAsO2對(duì)PC12細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響,本實(shí)驗(yàn)將在前期研究基礎(chǔ)上對(duì)這些問題進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞系 PC12細(xì)胞株,從中科院昆明細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買。

1.1.2試劑 亞砷酸鈉(S7400)購(gòu)于美國(guó)Sigma 公司。青霉素 - 鏈霉素(15140163)、高糖DMEM培養(yǎng)基(8120293)和胰蛋白酶(25200056)均購(gòu)自Gibco公司。胎牛血清(10099141C)于BioInd 公司購(gòu)買。XMU-MP-1(HY-100526)購(gòu)自MCE公司。一抗抗體LATS1(17049-1-AP)、MST1(22245-1-AP)、YAP1(13584-1-AP)、BAX(50599-2-Ig)、p53(10442-1-AP)和BCL-2(12789-1-AP)均在 ProteintechGroup公司購(gòu)買。Phospho-MST1(49332S)和Phospho-LATS1(9157S)購(gòu)自Cell Signaling Technology。Phospho-YAP1(ab76252)訂購(gòu)自Abcam。內(nèi)參抗體Tubulin(11224-1-AP)、Histone-H3(17168-1-AP)和GAPDH(10494-1-AP)于ProteintechGroup公司訂購(gòu)。抗兔 IgG-HRP二抗(ZB-2305)從北京中衫金橋訂購(gòu)。細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(KGA512)及細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒Annexin V-FITC /PI( KGA1012)于凱基生物購(gòu)買。核蛋白提取試劑盒(R0050)從索萊寶購(gòu)買。

1.1.3儀器 流式細(xì)胞儀FACSCalibur(美國(guó)BD公司),細(xì)胞超凈工作臺(tái)(蘇州凈化),凝膠全自動(dòng)成像儀(美國(guó) SynGene公司),全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(美國(guó) BioTek 公司),恒溫二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱Model 310(美國(guó)ThermoFisher公司),激光共聚焦顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) PC12細(xì)胞置于飽和濕度、37 ℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中,用含10% FBS和1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)基兩天更換一次,細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí),進(jìn)行傳代或凍存。

1.2.2細(xì)胞處理及分組 免疫熒光實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為control組和NaAsO2(40 μmol·L-1)組,其余實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞分為control組、NaAsO2(40 μmol·L-1)組、NaAsO2+XMU-MP-1(3 μmol·L-1)組、XMU-MP-1組。

1.2.3細(xì)胞周期檢測(cè) PC12細(xì)胞以5×108L-1的密度鋪于6孔板中培養(yǎng)過夜。以含3 μmol·L-1XMU-MP-1的高糖DMEM培養(yǎng)基對(duì)NaAsO2+XMU-MP-1組及XMU-MP-1組細(xì)胞預(yù)處理4 h。之后分別用含40 μmol·L-1NaAsO2、40 μmol·L-1NaAsO2+3 μmol·L-1XMU-MP-1、3 μmol·L-1XMU-MP-1的高糖培養(yǎng)基處理細(xì)胞,空白對(duì)照組以高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞處理24 h,無EDTA胰酶消化并收集。使用PBS進(jìn)行清洗,然后以1 100 r·min-1的速度離心5 min,這個(gè)步驟重復(fù)2次,并且丟棄上清液。接著,使用70%的乙醇在4 ℃下固定30 min,固定完成后以1 100 r·min-1的速度離心5 min并丟棄固定液。再次使用PBS清洗2次,加入300 μL的PI/RNase,避光在室溫下孵育60 min。最后,使用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡 本實(shí)驗(yàn)分組以及細(xì)胞收集、固定步驟同“1.2.3”。接著PBS洗2次,1 100 r·min-1離心棄上清。加500 μL PBS吹打得細(xì)胞懸液。然后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI振蕩混勻,避光冰上靜置20 min ,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5核質(zhì)分離 在處理完所有細(xì)胞組后,移除培養(yǎng)液并用PBS進(jìn)行一次清洗。然后,使用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞,以2 000 r·min-1的速度離心2 min,丟棄上清液。接著,加入200 μL的漿蛋白提取試劑,搖勻后在冰浴中放置10 min。然后進(jìn)行高速振蕩,4 ℃下以1.2×104r·min-1的速度離心10 min,取上清液(即細(xì)胞漿蛋白)備用。細(xì)胞核為沉淀物,加入50～100 μL的核蛋白提取試劑,高速渦旋15 s以確保充分分散,然后在冰浴中放置10 min。再次進(jìn)行高速渦旋,4 ℃下以1.2×104r·min-1的速度離心10 min,取上清液(即細(xì)胞核蛋白)。

1.2.6Western blot檢測(cè)經(jīng)過藥物處理的各組細(xì)胞,使用200 μL含有PMSF的RIPA裂解液在冰上裂解細(xì)胞10 min,然后以1.2×104r·min-1離心15 min。使用BCA法測(cè)量上清液的濃度。然后使用雙蒸水和5×上樣緩沖液將各組蛋白調(diào)至相同濃度,以100 ℃變性8 min。使用恒壓電泳將蛋白質(zhì)分離,然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下使用5%脫脂牛奶封閉2 h,然后在4 ℃下孵育一夜使用一抗(根據(jù)抗體說明書稀釋)或內(nèi)參(GAPDH、Tubulin、Histone-H3)。使用TBST洗膜5 min,重復(fù)3次,然后在室溫下孵育兔二抗(1 ∶10 000稀釋)2 h。再次使用TBST洗膜3次,使用化學(xué)發(fā)光方法,全自動(dòng)凝膠成像儀進(jìn)行檢測(cè),并用ImageJ軟件進(jìn)行蛋白條帶的分析和處理。

2 結(jié)果

2.1 NaAsO2對(duì)PC12細(xì)胞中YAP蛋白核質(zhì)分布的影響核質(zhì)分離,檢測(cè)YAP蛋白核質(zhì)分布,如Fig 1A所示,與control組相比,40 μmol·L-1NaAsO2組中YAP總蛋白的表達(dá)無變化,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的YAP蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05),而細(xì)胞核內(nèi)YAP蛋白的表達(dá)明顯減少(P<0.01)。利用免疫熒光對(duì)YAP蛋白染色,如Fig 1B所示,control組的細(xì)胞核顯示較強(qiáng)的紅色熒光,胞質(zhì)內(nèi)熒光強(qiáng)度較弱;而NaAsO2處理后,細(xì)胞核中的紅色熒光減弱,胞質(zhì)內(nèi)熒光增強(qiáng)。

Fig 1 Effect of NaAsO2 on YAP protein in cytoplasmic and nucleus of PC12 cells detected by Western blot (A) and immunofluorescence (B)

2.2 XMU-MP-1抑制NaAsO2激活Hippo-YAP通路如Fig 2所示,與control組相比,40 μmol·L-1NaAsO2處理PC12細(xì)胞24 h后,Hippo-YAP信號(hào)通路中的p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表達(dá)以及p-LATS1/LATS1、p-YAP/YAP比值增加(P<0.01)。而經(jīng)過XMU-MP-1(MST1/2抑制劑)預(yù)處理后,p-MST1、p-LATS1、p-YAP蛋白表達(dá)以及p-LATS1/LATS1、p-YAP/YAP比值相比于NaAsO2組均有所下調(diào)(P<0.05)。

Fig 2 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on expression of proteins associated with Hippo-YAP signaling pathway in PC12 cells

2.3 Hippo-YAP通路參與NaAsO2對(duì)PC12細(xì)胞周期的影響通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化,如Tab 1和Fig 3所示,與control組相比,XMU-MP-1對(duì)PC12細(xì)胞周期無影響。NaAsO2組G0/G1期細(xì)胞比例由control組的(63.80±0.69)%下降到(59.83±1.02)%(P<0.01),S期比例由control組的(17.25±1.09)%上升到(19.29±0.63)%(P<0.05),提示細(xì)胞周期被阻滯在S期。而XMU-MP-1預(yù)處理后,G0/G1期細(xì)胞比例由NaAsO2組的(59.83±1.02)%上升到(64.62±0.56)%(P<0.01),S期比例由NaAsO2組的(19.29±0.63)%下調(diào)到(16.71±0.31)%(P<0.01),可逆轉(zhuǎn)NaAsO2對(duì)S期的影響。

Tab 1 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on cell cycles

2.4 Hippo-YAP通路參與NaAsO2對(duì)PC12細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率,如Fig 4所示, PC12細(xì)胞經(jīng)NaAsO2處理24 h后,凋亡率由control組的3.83% 上升至11.00%(P<0.01),而XMU-MP-1預(yù)處理后,凋亡率由NaAsO2組的11.00%下降到6.88%(P<0.05)。然后,再利用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白,如Fig 5所示,與control組相比,NaAsO2處理24 h后明顯下調(diào)BCL-2蛋白表達(dá),上調(diào)BAX、P53蛋白表達(dá)(P<0.01)。而與NaAsO2組相比,XMU-MP-1預(yù)處理可以上調(diào)BCL-2蛋白表達(dá),下調(diào)P53、BAX蛋白表達(dá)(P<0.05)。兩部分結(jié)果都表明,XMU-MP-1預(yù)處理可以部分逆轉(zhuǎn)NaAsO2誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

Fig 3 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on cell cycles of PC12 cells

Fig 4 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on apoptosis rates of PC12 cells

3 討論

研究顯示,砷暴露嚴(yán)重影響學(xué)習(xí)記憶、認(rèn)知能力以及神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[9]。課題組前期研究證明NaAsO2可抑制PC12細(xì)胞生長(zhǎng)[10],促進(jìn)細(xì)胞凋亡,并且干擾細(xì)胞周期,激活Hippo-YAP信號(hào)通路[7]。

Fig 5 Effect of NaAsO2 and XMU-MP-1 on expression of apoptosis-related proteins in PC12 cells

Hippo-YAP信號(hào)通路是一條高度保守的信號(hào)通路,可以對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡進(jìn)行調(diào)控。文獻(xiàn)報(bào)道,Hippo-YAP通路激活時(shí),首先是MST1/2被磷酸化激活,然后MST1/2磷酸化LATS1/2,最終導(dǎo)致YAP蛋白磷酸化阻止其入核;而Hippo-YAP通路失活時(shí),未磷酸化的YAP蛋白轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,然后與轉(zhuǎn)錄因子TEAD結(jié)合以誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖相關(guān)的基因表達(dá)[5]。而用XMU-MP-1抑制MST1/2的活性可逆轉(zhuǎn)NaAsO2對(duì)Hippo-YAP通路的激活及對(duì)PC12細(xì)胞活力、形態(tài)及神經(jīng)突觸相關(guān)蛋白的影響[8]。本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),NaAsO2激活Hippo-YAP通路后可抑制YAP蛋白入核,這可能是Hippo-YAP通路參與NaAsO2對(duì)PC12細(xì)胞生長(zhǎng)的依據(jù)。

細(xì)胞周期分四個(gè)不同階段,DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)和有絲分裂期(M期)。毒性損傷會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的異常,使細(xì)胞周期停留在某一階段[11]。研究表明YAP蛋白可以促進(jìn)B-MYB和FOXM1表達(dá),并且誘導(dǎo)B-MYB與MuvB復(fù)合物在S期結(jié)合形成MMB亞復(fù)合物。MMB亞復(fù)合物招募FOXM1,在S/G2過渡期形成MMB:FOXM1復(fù)合物。進(jìn)入G2期后,B-MYB被降解,FOXM1磷酸化激活促進(jìn)G2/M期基因表達(dá),使細(xì)胞進(jìn)入M期[12]。研究發(fā)現(xiàn),利用siRNA敲低YAP表達(dá)將導(dǎo)致WB-F344細(xì)胞(大鼠肝上皮樣干細(xì)胞)停滯在G0/G1期[13]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NaAsO2處理PC12細(xì)胞24 h后p-YAP表達(dá)和S期細(xì)胞比例均明顯增加,細(xì)胞阻滯在S期[7]。而用XMU-MP-1阻斷Hippo-YAP通路則逆轉(zhuǎn)NaAsO2誘導(dǎo)的S期阻滯,表明Hippo-YAP通路參與NaAsO2對(duì)細(xì)胞周期的影響。

BCL-2可抑制細(xì)胞凋亡,而BAX則促進(jìn)凋亡的發(fā)生,當(dāng)BAX/BCL-2的比例增加時(shí),可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。P53是腫瘤抑制基因,其編碼的P53蛋白可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡,抑制腫瘤發(fā)生[15]。Jin等[16]發(fā)現(xiàn),YAP通過與TEAD相互作用并結(jié)合到BCL-2啟動(dòng)子區(qū)域來上調(diào)BCL-2轉(zhuǎn)錄。前期研究發(fā)現(xiàn)NaAsO2能增加PC12細(xì)胞凋亡及P53、BAX蛋白表達(dá)而下調(diào)BCL-2的表達(dá),提示NaAsO2可能通過促進(jìn)YAP磷酸化阻礙其入核,來抑制BCL-2表達(dá),從而促進(jìn)PC12細(xì)胞凋亡。利用XMU-MP-1阻斷Hippo-YAP通路則逆轉(zhuǎn)NaAsO2對(duì)細(xì)胞凋亡、P53、BCL-2和BAX表達(dá)的調(diào)控,表明Hippo-YAP通路參與NaAsO2對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)NaAsO2激活Hippo-YAP通路可改變YAP蛋白核質(zhì)分布,而NaAsO2誘導(dǎo)細(xì)胞S期阻滯和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的內(nèi)在機(jī)制可能涉及Hippo-YAP通路。然而,YAP如何進(jìn)一步調(diào)控細(xì)胞周期,是否通過結(jié)合啟動(dòng)子來調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),仍需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。