氧化苦參堿對(duì)氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞AMPK/mTOR途徑及自噬的影響

崔明宇,盧金瑩,于 露, 王宇彤,邊 疆,王 高,楊新霞,楊 菁

(錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,遼寧 錦州 121001)

腦缺血/再灌注損傷(ischemia reperfusion injury, IRI)已經(jīng)成為我國(guó)居民第一位致殘和致死原因[1]。星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte, AS)是腦組織中數(shù)量最多的一種膠質(zhì)細(xì)胞,在腦IRI中發(fā)揮重要作用,因此減輕AS在腦IRI中的損傷具有重要意義。自噬對(duì)維持細(xì)胞的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮重要作用[2]。腦IRI后AS自噬被激活,通過(guò)降解受損細(xì)胞器維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和正常細(xì)胞功能,AS自噬與腦IRI密切相關(guān)[2]。

氧化苦參堿(oxymatrine, OMT)是一種天然生物堿,在老齡相關(guān)的代謝和認(rèn)知功能退變中具有重要的臨床應(yīng)用前景[3-4]。OMT對(duì)急性腦梗死大鼠[5]及脂多糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷均具有保護(hù)作用[6],同時(shí)對(duì)自噬也具有調(diào)節(jié)作用[7]。但OMT調(diào)節(jié)自噬的作用對(duì)AS的氧糖剝奪/復(fù)糖復(fù)氧(oxygen-glucose deprivation and reperfusion injury, OGD/R)損傷是否有保護(hù)作用未見報(bào)道。本研究采用體外培養(yǎng)的大鼠AS,通過(guò)建立OGD/R模型,觀察OMT對(duì)AMPK/mTOR途徑及自噬影響,探討OMT抑制OGD/R損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康新生24 h的Sprague-Dawley大鼠,雌雄不限,由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物合格證編號(hào): SCXK (遼) 2022-0004。實(shí)驗(yàn)經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn),批準(zhǔn)編號(hào):2022031001。

1.2 藥品與試劑氧化苦參堿,純度≥98%(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司,批號(hào):21052128);3-甲基腺嘌呤(3-MA)(美國(guó)MedChemExpress公司,貨號(hào):HY-19312)。DMEM/F12無(wú)糖基礎(chǔ)培養(yǎng)液(武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號(hào):PM150322);新生牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司,貨號(hào):003917);青霉素-鏈霉素溶液(100×)、胰酶細(xì)胞消化液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司,貨號(hào)分別為:C0222、C0201)。GFAP一抗(Biolegend公司,貨號(hào):644701);p-AMPK、 AMPK、p-mTOR、mTOR、Beclin 1、LC3B、p62、β-actin一抗(ABclonal生物科技有限公司,貨號(hào)分別為:AP0432、A1229、AP0115、A2445、A7353、A19665、A11483、AC006)。

1.3 儀器生物安全柜(中國(guó)海爾生物醫(yī)療公司);CO2培養(yǎng)箱、三氣低氧培養(yǎng)箱(中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司);臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司);超速離心機(jī)(日本日立公司);倒置生物顯微鏡(德國(guó)Zeiss公司);熒光倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司);多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.4 方法

1.4.1大鼠大腦皮層AS培養(yǎng)及鑒定 新生24 h內(nèi)的大鼠,用75%酒精浸泡消毒30 s。取雙側(cè)大腦皮質(zhì)后用D-Hank′s緩沖液沖洗3遍,去除血絲和雜物。將組織剪成約1 mm3大小組織塊后,加入約2倍組織體積的0.25%胰酶細(xì)胞消化液,緩緩吹打混勻轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中,于37 ℃培養(yǎng)箱中消化10 min。再加入與胰酶細(xì)胞消化液等體積的含10%新生牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液的 DMEM/F-12完全培養(yǎng)液終止消化,吹打混勻。用200目濾網(wǎng)過(guò)濾組織液,800×g離心5 min,棄上清,再加入2 mL完全培養(yǎng)液,吹懸細(xì)胞。吹勻接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中,再補(bǔ)入3 mL完全培養(yǎng)液,置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4 h后,收集上層未貼壁細(xì)胞懸液,加入至新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng),間隔2～3天換液。細(xì)胞增殖至培養(yǎng)瓶底80%左右進(jìn)行傳代處理,傳至第3代備用[8]。在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并用免疫熒光檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)進(jìn)行純度鑒定。

1.4.2OGD/R模型的建立及分組 取第3代AS,待細(xì)胞增殖至培養(yǎng)瓶底80%左右時(shí),移除完全培養(yǎng)基(含10%新生牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM/F-12),用基礎(chǔ)培養(yǎng)基(含0.5%新生牛血清+1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM/F-12)沖洗細(xì)胞3遍后,加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h進(jìn)行血清饑餓處理。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(CON)、模型組(OGD/R)、OGD/R+OMT(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)。血清饑餓結(jié)束前1 h,各組更換基礎(chǔ)培養(yǎng)液,但OGD/R+OMT各組分別加入相應(yīng)終濃度的OMT。血清饑餓結(jié)束后,CON組換成完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)30 h,而OGD/R組、OGD/R+OMT組換成1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM/F12無(wú)血清無(wú)糖培養(yǎng)液,內(nèi)含OMT分別為0、0.1、0.2、0.4 mmol·L-1,放置于三氣低氧培養(yǎng)箱(95% N2、5% CO2)37 ℃培養(yǎng)6 h,再換成相對(duì)應(yīng)濃度OMT的完全培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)24 h。

1.4.3MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 取第3代AS,以5×103個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi),按1.4.2中的實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)處理。復(fù)氧結(jié)束后,避光棄去上清溶液,在每孔中加入20 μL的MTT(5 g·L-1)溶液與80 μL的無(wú)血清培養(yǎng)液,置5% CO2培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)4 h。避光棄去上清溶液,每孔加入150 μL的DMSO,于多功能酶標(biāo)儀上自動(dòng)振板并檢測(cè)490 nm的A值。以不含細(xì)胞的孔調(diào)零,以對(duì)照組細(xì)胞的存活率為100%,細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/(對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,并設(shè)3個(gè)復(fù)孔,取平均值為最終結(jié)果。

1.4.4Hoechst 33342染色法檢測(cè)AS凋亡 取第3代AS,以1×104個(gè)/孔的密度接種于24 孔培養(yǎng)板內(nèi),按1.4.2中的實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)處理。復(fù)氧結(jié)束后,棄去原培養(yǎng)液,用PBS清洗3次,3 min/次。室溫下用4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗3次,3 min/次。每孔加入500 μL 10 mg·L-1Hoechst 33342染液,37 ℃避光染色30 min,PBS清洗3次,3 min/次,熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.4.5Annexin V-FITC法測(cè)定細(xì)胞凋亡 取第3代AS,以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中,待細(xì)胞貼壁達(dá)80%～90%時(shí),按1.4.2中的實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)處理后,用0.25%的胰酶37 °C消化5 min,收集細(xì)胞懸液于對(duì)應(yīng)的離心管中,離心棄上清,1 000×g,離心5 min,吸除上清。加1 mL 4 ℃預(yù)冷的PBS,吹散細(xì)胞,1 000×g離心5 min,吸除上清。用緩沖液重新懸浮細(xì)胞,調(diào)節(jié)其濃度為(1～5)×109·L-1。取100 μL的細(xì)胞懸液于流式管中,加入5 μL Annexin V-FITC搖勻,置于室溫避光孵育5 min,流式上機(jī)檢測(cè)。

1.4.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)AS中ROS水平 取第3代AS,以2×105個(gè)/孔的密度接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi),按1.4.2中的實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)處理,本實(shí)驗(yàn)依據(jù)活性氧檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書方法,采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.7Western blot法檢測(cè)AS中自噬調(diào)控分子 AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR及自噬相關(guān)蛋白Beclin 1、LC3B、p62的表達(dá) 取第3代AS,以1×106個(gè)/孔的密度接種于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi),按1.4.2中的實(shí)驗(yàn)分組給予相應(yīng)處理。復(fù)氧結(jié)束后,取出培養(yǎng)皿,用細(xì)胞刮刀收集各組細(xì)胞,并于冰上裂解(裂解液按照RIPA ∶PMSF=100 ∶1濃度配制)收樣。BCA法測(cè)定蛋白含量,常規(guī)Western blot法檢測(cè)AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、Beclin 1、LC3B、p62蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 AS純度鑒定鑒定如Fig 1所示,光鏡下可見培養(yǎng)的AS為不規(guī)則的多角形,有枝狀胞突,胞體扁平,符合AS特性。熒光顯微鏡下可見AS特異性標(biāo)記物GFAP呈紅色,細(xì)胞核染料DAPI呈藍(lán)色,計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)。通過(guò)計(jì)數(shù)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞中的數(shù)量來(lái)計(jì)算純度,培養(yǎng)細(xì)胞純度在98%以上,符合實(shí)驗(yàn)需要。

2.2 OMT對(duì)AS存活率的影響為驗(yàn)證OMT對(duì)AS毒性,完全培養(yǎng)液中加入終濃度在0.1～51.2 mmol·L-1的OMT培養(yǎng)24或48 h后檢測(cè)細(xì)胞存活率,結(jié)果發(fā)現(xiàn)濃度低于6.4 mmol·L-1時(shí)兩個(gè)時(shí)間段各組存活率與CON組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而高于該濃度時(shí),細(xì)胞成活率隨著OMT濃度升高明顯降低(P<0.01或P<0.05),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見Fig 2A。為保證藥物安全性,OMT濃度不能大于6.4 mmol·L-1。為驗(yàn)證OMT藥效,選擇OGD/R誘導(dǎo)AS損傷模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)OGD/R后細(xì)胞存活率明顯降低(P<0.01),說(shuō)明OGD/R后AS損傷明顯;而經(jīng)過(guò)OMT預(yù)處理后,AS細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.01),隨著藥物濃度升高AS存活率進(jìn)一步升高,但到0.4 mmol·L-1后,各濃度組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為探討OMT的作用機(jī)制,后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇0.1、0.2、0.4 mmol·L-13個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),見Fig 2B。

2.3 OMT對(duì)OGD/R損傷AS凋亡的影響采用Hoechst 33342染色及Annexin V-FITC法檢測(cè)AS細(xì)胞的凋亡,結(jié)果顯示,與CON組相比,OGD/R組凋亡率明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與OGD/R組相比,OGD/R+OMT(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)組細(xì)胞凋亡率明顯降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且隨著OMT濃度增加凋亡率降低的更為明顯,見Fig 3。

2.4 OMT對(duì)OGD/R誘導(dǎo)AS損傷ROS的影響如Fig 4所示,與CON組相比,ODG/R組ROS含量明顯升高(P<0.01);而OMT可以明顯抑制ROS升高,與ODG/R組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5 OMT對(duì)OGD/R誘導(dǎo)AS損傷AMPK-mTOR信號(hào)通路及自噬相關(guān)蛋白的影響與CON組比較,OGD/R組p-AMPK/AMPK和LC3B Ⅱ/Ⅰ比值及Beclin 1含量明顯升高(P<0.01),p-mTOR/mTOR比值與p62含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與OGD/R組相比,OGD/R+OMT(0.1、0.2、0.4 mmol·L-1)組p-AMPK/AMPK和LC3B Ⅱ/Ⅰ比值及Beclin 1含量降低,p-mTOR/mTOR比值與p62含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),見Fig 5。

Fig 1 Identification of astrocyte(scale bar=100 μm, ×200)

Fig 2 Effect of OMT on cell viability of AS (A) and AS cells injured by OGD/R (B) detected by n=9)

2.6 自噬在OMT對(duì)損傷保護(hù)中的作用為驗(yàn)證自噬在OMT對(duì)ODG/R損傷保護(hù)中的作用,加入自噬抑制劑3-MA進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)分為CON組、OGD/R組、OGD/R+OMT(0.4 mmol·L-1)組、OGD/R+3-MA組及OGD/R+OMT(0.4 mmol·L-1)+3-MA組。含3-MA各組需在缺氧處理前15 min加入終濃度為1 mmol·L-1的3-MA[9],其余同1.4.2中實(shí)驗(yàn)分組處理。結(jié)果顯示,與OGD/R相比,OGD/R+3-MA組的細(xì)胞存活率由OGD/R組的(50.1±3.3)%升高為(79.9±5.8)%。與OGD/R+OMT 組相比,OGD/R+OMT+3-MA組細(xì)胞存活率升高,但兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Fig 6A)。Western blot的結(jié)果也顯示3-MA可以使LC3B Ⅱ/Ⅰ比值降低及p62含量增加(Fig 6B),見Fig 6。

Fig 4 Effect of OMT on ROS of AS injured by OGD/R detected by flow n=9)

Fig 5 Effect of OMT on expression of AMPK, mTOR, Beclin 1, LC3 Ⅱ/Ⅰ and p62 protein in AS after OGD/R-induced injury

3 討論

AS在哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量眾多,對(duì)神經(jīng)元起到營(yíng)養(yǎng)支持等重要作用,其損傷程度與腦IRI的預(yù)后密切相關(guān)[10]。采用體外培養(yǎng)AS來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),利用特異性標(biāo)記物GFAP進(jìn)行細(xì)胞純度鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)GFAP陽(yáng)性細(xì)胞在98%以上,培養(yǎng)AS純度符合實(shí)驗(yàn)要求。首先觀察了OMT對(duì)AS的影響,當(dāng)OMT濃度小于6.4 mmol·L-1時(shí)細(xì)胞存活率與CON組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但OMT濃度繼續(xù)升高則細(xì)胞存活率明顯降低,說(shuō)明高于6.4 mmol·L-1的OMT對(duì)AS具有毒性作用。對(duì)體外培養(yǎng)的AS細(xì)胞進(jìn)行OGD/R來(lái)模擬IRI,選定氧糖剝奪6 h再恢復(fù)正常培養(yǎng)24 h來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與CON組相比,OGD/R組AS的存活率明顯下降(P<0.01),細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01),提示缺氧6 h復(fù)氧24 h造成AS損傷;而OMT對(duì)OGD/R損傷具有保護(hù)作用,其中OMT的0.1、0.2、0.4 mmol·L-13個(gè)濃度組的變化最為明顯。為進(jìn)一步探討OMT作用機(jī)制,后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用該3個(gè)濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

ROS是線粒體呼吸鏈氧化代謝主要副產(chǎn)物,其大量產(chǎn)生在OGD/R后AS損傷中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,OGD/R后ROS含量明顯升高(P<0.01),而OMT可以明顯降低ROS的含量(P<0.01),隨著OMT濃度的升高,抑制效果更明顯,因此推斷OMT的保護(hù)作用與其較強(qiáng)的抗氧化能力有關(guān),該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道類似[5]。

Fig 6 Effect of autophagy inhibitor 3-MA on protection of OMT on AS viability (A) and expression of LC3 Ⅱ/Ⅰ and p62 protein (B) injured by OGD/R

越來(lái)越多的證據(jù)表明,ROS和細(xì)胞自噬在腦IRI中互相影響[11]。細(xì)胞自噬是指通過(guò)溶酶體降解自身組分來(lái)維持細(xì)胞正常功能的一種細(xì)胞代謝過(guò)程。腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase,AMPK)可以感知能量的減少,并通過(guò)調(diào)節(jié)ATP生成增加及消耗減少來(lái)恢復(fù)能量穩(wěn)態(tài)[12]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)可通過(guò)刺激生物合成代謝,并通過(guò)降低細(xì)胞自噬來(lái)抑制分解代謝[13]。AMPK主要通過(guò)抑制mTOR通路增加自噬[14]。Beclin 1是哺乳動(dòng)物中與酵母ATG6同源的蛋白,Beclin 1通過(guò)活化Vps34 促進(jìn)自噬[15];LC3 Ⅱ的形成是自噬小體形成的必要條件,其表達(dá)水平與自噬水平呈正相關(guān)[16];自噬銜接蛋白p62是一種常見的自噬相關(guān)蛋白,其在自噬過(guò)程中不斷在溶酶體中被降解,因此p62的表達(dá)通常與細(xì)胞自噬呈負(fù)相關(guān)[16]。自噬對(duì)細(xì)胞的作用是個(gè)雙刃劍,取決于損傷程度、外周環(huán)境等因素[17]。過(guò)度自噬是IRI的關(guān)鍵因素。OGD/R時(shí),胞內(nèi)ATP含量降低時(shí),AMPK 激活會(huì)抑制mTOR,從而促進(jìn)自噬[18]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與CON組相比,OGD/R時(shí),p-AMPK/AMPK和LC3B Ⅱ/Ⅰ比值及Beclin1含量升高,p-mTOR/mTOR比值及p62含量降低;而OMT可以使p-AMPK/AMPK和LC3B Ⅱ/Ⅰ比值及Beclin1含量降低,p-mTOR/mTOR比值及p62含量升高,提示OMT可通過(guò)抑制p-AMPK,激活mTOR進(jìn)而抑制自噬過(guò)度激活來(lái)發(fā)揮作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證自噬在OMT對(duì)OGD/R損傷AS保護(hù)中的作用,選擇自噬抑制劑3-MA進(jìn)行了實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明3-MA可以明顯抑制OGD/R引起的AS損傷,但和OGD/R+OMT+3-MA組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明自噬在OMT保護(hù)OGD/R對(duì)AS損傷中發(fā)揮重要作用。

綜上所述,OMT預(yù)處理可有效降低OGD/R造成的AS細(xì)胞損傷,其作用可能與OMT通過(guò)發(fā)揮其抗氧化能力,調(diào)節(jié)AMPK/mTOR通路降低自噬有關(guān)。