從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激研究高脂飲食對(duì)小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響

周本文,張長(zhǎng)城,鄧 何,陳思敏,常言語(yǔ),楊焱娜,付國(guó)慶,袁 丁,趙海霞

(三峽大學(xué) 1.國(guó)家中醫(yī)藥管理局中藥藥理科研三級(jí)實(shí)驗(yàn)室、2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院、3.健康醫(yī)學(xué)院,湖北 宜昌 443002)

肥胖與飲食結(jié)構(gòu)密切相關(guān),臨床研究表明,肥胖是引起男性生育能力低下的重要因素[1]。過(guò)量攝入脂肪酸會(huì)增加患弱精子癥的概率;此外,精漿中總膽固醇和甘油三酯水平與精液質(zhì)量呈負(fù)相關(guān),與精子DNA碎片指數(shù)呈正相關(guān)[2]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn),長(zhǎng)期高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖可導(dǎo)致小鼠[3]或大鼠[4]生殖細(xì)胞過(guò)度凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致睪丸組織結(jié)構(gòu)損傷,精液質(zhì)量下降,最終導(dǎo)致小鼠或大鼠生育能力低下甚至不育。因此,睪丸生精細(xì)胞的異常凋亡可能是肥胖相關(guān)的雄性生精功能障礙的關(guān)鍵。然而,其具體分子機(jī)制在很大程度上仍然未知。

研究表明[5],內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)與高脂飲食密切相關(guān)。而ERS對(duì)于維持睪丸正常的生殖功能發(fā)揮著不可或缺的作用,ERS損傷通常是引起睪丸精子發(fā)生異常的重要誘因[6]。然而,持續(xù)過(guò)度的ERS會(huì)誘導(dǎo)睪丸生精細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致睪丸生殖功能受損,影響正常的精子發(fā)生[7]。有研究發(fā)現(xiàn)[8],高脂飲食可通過(guò)激活肝臟ERS誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡。那么,高脂飲食誘導(dǎo)的生精細(xì)胞凋亡是否與睪丸ERS有關(guān),還有待進(jìn)一步研究。因此,本實(shí)驗(yàn)首先檢測(cè)高脂飲食對(duì)生精細(xì)胞凋亡的影響,然后從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白PERK、IRE1和ATF6介導(dǎo)的ERS的3條信號(hào)通路來(lái)研究高脂飲食對(duì)小鼠睪丸ERS的作用,初步探討ERS在高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物12只5周齡無(wú)特定病原體級(jí)的C57BL/6J雄性小鼠購(gòu)買(mǎi)并飼養(yǎng)于三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,室溫23 ℃～26 ℃、相對(duì)濕度60%～65%,照明系統(tǒng)自動(dòng)控制12 h明暗交替循環(huán)。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(鄂)2017-0012。所有小鼠可進(jìn)行自由進(jìn)食與飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后分組處理。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),并且按照“三峽大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南”開(kāi)展,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用許可證號(hào):SYXK(鄂)2017-0061。

1.2 試劑β-actin(AC026)購(gòu)自ABclonal公司;GRP78(abs130538)購(gòu)自Absin公司;p-IRE1(NB100-2323)購(gòu)自Novus公司;XBP1(ab37152)、eIF2S1 (phospho S51)(ab32157)和ATF4(ab184909)購(gòu)自Abcam公司;p-pERK(Thr 981)(sc-32577)和ATF6α(SC-166659)購(gòu)自Santa cruz公司;Bcl-2(26593-1-AP)和Bax(50599-2-Ig)購(gòu)自Proteintech公司;cleaved-caspase-12(#35965)購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;牛血清白蛋白(BSA)(154707)和anti-Rabbit lgG(H+L)(KR0023)購(gòu)自武漢科瑞生物有限公司;anti-mouse lgG(H+L)(115-035-003)和Alexa Fluor488 Donkey Anti-Rabbit lgG(H+L)(711-545-152)購(gòu)自Jackson immunoresearch公司;RIPA裂解液試劑盒(EXP202304)和BCA蛋白定量試劑盒(EXP202310)購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(CR2204003)、4%多聚甲醛(CR2209049)和抗熒光淬滅封片劑(CR2207103)購(gòu)自Servicebio公司;YF 594 TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(T6014S)購(gòu)自百賽生物公司。

1.3 儀器LEICA TP1020型全自動(dòng)脫水機(jī)和LEICA EG1150H型包埋機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司;YD-335型切片機(jī)購(gòu)自湖北澤川科技有限公司;DP260全自動(dòng)智能染色機(jī)購(gòu)自深圳市達(dá)科為公司;AX224ZH/E型電子天平購(gòu)自?shī)W豪斯儀器有限公司;BX53光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本Olympus公司;TYPE1500-458型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo Electron公司;RX50熒光顯微鏡購(gòu)自北京舜宇光學(xué)儀器公司;ChemiScope 6100型化學(xué)發(fā)光儀購(gòu)自上海勤翔科學(xué)儀器公司;PowerPac 200型Western blot電泳儀購(gòu)自英國(guó)Bio-Rad公司;DS1000型組織勻漿儀購(gòu)自湖北新縱科公司。

1.4 方法

1.4.1分組給藥 將12只6周齡無(wú)特定病原體級(jí)的C57BL/6J雄性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組,即正常飲食(Normal diet,ND)組和高脂飲食(High-fat diet,HFD)組,每組6只,分籠(3～4只/籠)。HFD組小鼠給予含60%脂肪的高脂飼料喂養(yǎng),ND組小鼠給予普通的維持飼料喂養(yǎng),持續(xù)喂養(yǎng)5個(gè)月。高脂飼料(編號(hào)H10060)購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司,能量配比(Kcal):脂肪占0.60,蛋白質(zhì)占0.20,碳水化合物占0.20。

1.4.2小鼠體質(zhì)量和睪丸指數(shù)的測(cè)定 造模結(jié)束后,所有小鼠禁食不禁水12 h,稱(chēng)體質(zhì)量,以200 g·L-1的烏拉坦腹腔麻醉小鼠,頸椎脫臼法處死小鼠,于低溫環(huán)境中迅速摘取并分離小鼠睪丸和附睪,稱(chēng)質(zhì)量并計(jì)算睪丸指數(shù),睪丸指數(shù)(mg·g-1)=睪丸質(zhì)量(mg)/體質(zhì)量(g)。

1.4.3精液分析 將兩側(cè)附睪組織迅速放入含有1 mL的生理鹽水中,并將附睪組織剪碎,放置在37 ℃恒溫箱中孵育3 min,使附睪中精子充分游離出來(lái),制備精子懸液。將20 μL精子懸液和480 μL生理鹽水充分混勻,取10 μL稀釋后的精子懸液采用血球計(jì)數(shù)板在光鏡下觀察并計(jì)數(shù)精子的數(shù)量,計(jì)算精子濃度,精子濃度(mL)=計(jì)數(shù)板4象限中精子的平均數(shù)×104×稀釋倍數(shù)。另取10 μL精子懸液與10 μL伊紅Y溶液充分混勻后,滴加到載玻片上,染色30 s后在顯微鏡下觀察精子的活率,計(jì)數(shù)活精子數(shù)和精子總數(shù),計(jì)算精子活率,精子活率=活精子數(shù)/精子總數(shù)×100%。

1.4.4HE染色觀察睪丸組織形態(tài) 睪丸組織脫水、包埋:睪丸組織取材后迅速放入含4%多聚甲醛的離心管中浸泡24 h,使組織充分固定。將組織轉(zhuǎn)移置自動(dòng)脫水機(jī)中進(jìn)行脫水,脫水程序結(jié)束后將組織轉(zhuǎn)移至石蠟包埋機(jī)中(提前預(yù)熱包埋機(jī)),將組織放入包埋夾中制成石蠟塊。石蠟切片:將組織蠟塊用切片機(jī)進(jìn)行切片,厚度為4 μm。HE染色和取圖:采用自動(dòng)染色機(jī)對(duì)組織切片進(jìn)行HE染色,染色結(jié)束后立即用中性樹(shù)脂進(jìn)行封片。取圖:將切片于光學(xué)顯微鏡下觀察睪丸生精小管和生精上皮的形態(tài)結(jié)構(gòu)并取圖。根據(jù)光鏡下采集的放大倍數(shù)為100倍的圖片,使用ImageJ軟件測(cè)量每個(gè)生精小管的直徑和上皮厚度,每組統(tǒng)計(jì)6只小鼠,每只小鼠統(tǒng)計(jì)80～100個(gè)生精小管,計(jì)算平均值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4.5TUNEL染色檢測(cè)睪丸凋亡細(xì)胞 將包埋好的睪丸石蠟塊進(jìn)行切片(方法同HE染色),將切片進(jìn)行脫蠟水化,每個(gè)組織上加入100 μL蛋白酶K溶液,并置于37℃恒溫箱孵育30 min,PBS漂洗3次,然后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行TUNEL反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后,將組織用PBS漂洗3次,隨后DAPI復(fù)染,抗熒光淬滅劑封片,在熒光顯微鏡下觀察,隨機(jī)選取100個(gè)生精小管,計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),計(jì)算凋亡指數(shù)(凋亡指數(shù)=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/100),每組統(tǒng)計(jì)3只小鼠。

1.4.6Western blot檢測(cè)睪丸凋亡及ERS相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 蛋白提取:使用電子天平稱(chēng)取20 mg的睪丸組織,加入400 μL的RIPA裂解液,放入勻漿儀中進(jìn)行碾碎,然后置于冰上裂解1 h。提前預(yù)冷離心機(jī),設(shè)置轉(zhuǎn)速為12 000 r·min-1,將組織4 ℃離心10 min,收集上清液即蛋白提取完成。蛋白樣品濃度的測(cè)定:于96孔板中每孔依次加入25 μL的PBS緩沖液、2.5 μL提取的蛋白母液和200 μL的BCA工作液,37 ℃恒溫箱孵育30 min。采用酶標(biāo)儀檢測(cè)蛋白樣品在562 nm處的A值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算蛋白母液的濃度。Western blot:取100 μL的蛋白液加入25 μL上樣緩沖液,充分渦旋混勻,將蛋白樣品于100 ℃水浴鍋中加熱10 min,使蛋白充分變性。將制好的蛋白樣品進(jìn)行電泳,轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)膜完成的條帶使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的牛奶室溫封閉1 h,然后在4 ℃孵育一抗12～14 h,TBST洗膜3次(6 min/次),室溫繼續(xù)孵育二抗1 h,TBST洗膜3次(6 min/次)后,最后在化學(xué)發(fā)光儀中顯影。

1.4.7免疫熒光檢測(cè)睪丸組織中GRP78的表達(dá)和定位 取睪丸組織切片在60 ℃烤箱中烘烤30 min,將切片浸入二甲苯中脫蠟(30 min),然后分別放入梯度乙醇(100%、95%、85%、70%)中復(fù)水(每次10 min),隨后將組織切片放入檸檬酸修復(fù)液中,高壓修復(fù)10 min,冷卻至室溫,在組織上加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% BSA溶液室溫封閉60 min,隨后去掉封閉液,在組織上加入GRP78一抗稀釋液并將切片放入濕盒中,置于4 ℃孵育12～14 h。孵育結(jié)束取出濕盒,復(fù)溫30 min。去掉一抗稀釋液,采用PBS緩沖液漂洗5次(6 min/次)。滴加Alexa Fluor488 Donkey Anti-Rabbit lgG(H+L)抗體稀釋液,在室溫條件下孵育60 min,PBS浸洗30 min(同上,從此步驟開(kāi)始全程均避光操作),滴加DAPI工作液染色10 min,PBS漂洗3次,每次10 min,使用抗熒光淬滅劑封片。在熒光顯微鏡下觀察小鼠睪丸組織中GRP78蛋白的表達(dá)及定位,每個(gè)組織隨機(jī)選取3～5個(gè)視野采集圖像,每組檢測(cè)3只小鼠。

2 結(jié)果

2.1 高脂飲食對(duì)小鼠體質(zhì)量和睪丸指數(shù)的影響結(jié)果如Fig 1所示,與ND組相比,HFD組小鼠體質(zhì)量明顯增加(P<0.01),睪丸指數(shù)明顯下降(P<0.05)。

Fig 1 Effects of high-fat diet on body weight and testicular index of mice

2.2 高脂飲食對(duì)小鼠精子濃度和精子活率的影響結(jié)果如Fig 2A所示,活的精子不被伊紅Y染色,而死精子則被伊紅Y染成紅色,與ND組相比,HFD組小鼠死的精子明顯增多;統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,HFD組小鼠精子濃度(P<0.05)和精子活率(P<0.01)明顯下降,見(jiàn)Fig 2B,C。

Fig 2 Effects of high-fat diet on sperm concentration and sperm viability of mice

2.3 高脂飲食對(duì)小鼠睪丸組織形態(tài)的影響結(jié)果如Fig 3A所示,ND組小鼠生精上皮結(jié)構(gòu)完整,各級(jí)生精細(xì)胞從生精小管基底向管腔排列且緊密有序;與ND組相比,HFD組小鼠睪丸各級(jí)生精細(xì)胞排列松散、紊亂、基底層生精細(xì)胞出現(xiàn)脫落,生精細(xì)胞層數(shù)減少。生精上皮厚度和生精小管直徑統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,與ND組相比,HFD組小鼠生精上皮厚度變薄(P<0.05),生精小管直徑差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)Fig 3B,C。

2.4 高脂飲食對(duì)小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響TUNEL染色結(jié)果顯示,與ND組相比,HFD組小鼠睪丸組織中TUNEL陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增多。結(jié)果顯示,與ND組相比,HFD組小鼠睪丸凋亡指數(shù)明顯上升(P<0.01),見(jiàn)Fig 4。

Fig 3 Effects of high-fat diet on morphology of testicular tissue of mice

2.5 高脂飲食對(duì)小鼠睪丸組織中Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-12蛋白表達(dá)的影響采用Western blot法對(duì)睪丸組織中Bax、Bcl-2和cleaved-caspase-12的表達(dá)水平的進(jìn)行檢測(cè),研究高脂飲食對(duì)小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果如Fig 5所示,與ND組相比,HFD組Bax和cleaved-caspase-12蛋白表達(dá)水平明顯上升(P<0.05),抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)明顯下降(P<0.05),而B(niǎo)ax與Bcl-2蛋白表達(dá)水平的比值明顯上升(P<0.01)。以上結(jié)果提示,高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡。

2.6 高脂飲食對(duì)小鼠睪丸組織GRP78蛋白表達(dá)及定位的影響為了研究高脂飲食對(duì)小鼠睪丸ERS的影響,首先采用Western blot法檢測(cè)睪丸ERS標(biāo)志蛋白GRP78的表達(dá)量的變化,結(jié)果如Fig 6A所示,高脂飲食可明顯上調(diào)睪丸組織GRP78蛋白表達(dá)水平(P<0.05)。隨后采用免疫熒光法進(jìn)一步檢測(cè)睪丸生精上皮細(xì)胞中GRP78蛋白表達(dá)和定位的變化,結(jié)果如Fig 6B所示,在正常小鼠睪丸生精細(xì)胞中GRP78主要表達(dá)于生精上皮初級(jí)精母細(xì)胞的胞質(zhì)中,呈圓環(huán)狀包圍在細(xì)胞核外側(cè)(白色箭頭所示)。與ND組相比,HFD組小鼠睪丸生精細(xì)胞中GRP78表達(dá)明顯增多,表達(dá)位置無(wú)明顯變化。結(jié)果提示,高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠睪丸生精細(xì)胞ERS。

Fig 4 Effects of high-fat diet on apoptosis of germ cells

Fig 5 Effects of high-fat diet on apoptosis related protein expression of mouse testicular tissue

2.7 高脂飲食對(duì)小鼠睪丸組織PERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果顯示,與ND組相比,HFD組小鼠睪丸組織中p-PERK和p-eIF2α蛋白表達(dá)有上升的趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而ATF4蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化,見(jiàn)Fig 7。

2.8 高脂飲食對(duì)小鼠睪丸組織IRE1信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如Fig 8所示,與ND組相比,HFD組小鼠睪丸組織中p-IRE1和XBP1蛋白的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。結(jié)果提示,高脂飲食可通過(guò)激活I(lǐng)RE1信號(hào)通路,引發(fā)睪丸ERS。

Fig 6 Effects of high-fat diet on GRP78 expression of mouse testicular or 4)

Fig 7 Effects of high-fat diet on expression of PERK signaling pathway related proteins in mouse testicular tissue

Fig 8 Effects of high-fat diet on expression of IRE1 signaling pathway related proteins in mouse testicular tissue *P<0.05 vs ND group.

2.9 高脂飲食對(duì)小鼠睪丸組織ATF6信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果如Fig 9所示,與ND組相比,HFD組小鼠睪丸組織中ATF6α蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.05)。結(jié)果提示,高脂飲食可激活A(yù)TF6信號(hào)通路。

Fig 9 Effects of high-fat diet on expression of ATF6 signaling pathway related proteins in mouse testicular tissue *P<0.05 vs ND group.

3 討論

在全球范圍內(nèi),超重和肥胖的人群越來(lái)越多,約13%的成年人肥胖,并且在未來(lái)幾年將繼續(xù)迅速上升。肥胖與飲食結(jié)構(gòu)密切相關(guān),高脂肪高熱量飲食更容易引起體質(zhì)量增加,導(dǎo)致高脂血癥,引發(fā)代謝相關(guān)等疾病,并且經(jīng)常會(huì)導(dǎo)致雄性睪丸功能受損和生育能力低下[9]。研究表明,高脂飲食可誘導(dǎo)雄性小鼠和大鼠精子數(shù)量和活力降低,導(dǎo)致睪丸組織結(jié)構(gòu)受損,生精細(xì)胞凋亡增加,進(jìn)而導(dǎo)致其生育力受損甚至不育[10]。然而,外界條件刺激引起的生精細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致雄性生殖功能障礙的關(guān)鍵因素之一。有研究發(fā)現(xiàn),小鼠腹腔注射飽和脂肪酸棕櫚酸可誘導(dǎo)睪丸脂質(zhì)積累,生精細(xì)胞凋亡增多進(jìn)而導(dǎo)致小鼠生殖功能障礙;體外實(shí)驗(yàn)亦表明棕櫚酸可誘導(dǎo)凋亡相關(guān)蛋白Bax/Bcl-2表達(dá)的比值和cleaved-caspase-12蛋白的表達(dá)上調(diào),導(dǎo)致精原細(xì)胞凋亡[11]。本研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠體質(zhì)量明顯增加,睪丸指數(shù)降低,小鼠精子濃度和活率明顯下降,睪丸組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯的損傷,生精細(xì)胞排列紊亂,生精上皮結(jié)構(gòu)松散,基底層生精細(xì)胞脫落,生精上皮厚度變薄,睪丸組織中凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多,凋亡指數(shù)明顯增加。另外,Western blot結(jié)果顯示,高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleaved-caspase-12的表達(dá)明顯升高,而B(niǎo)cl-2蛋白的表達(dá)明顯下降,Bax與Bcl-2表達(dá)水平的比值明顯升高。以上結(jié)果表明,高脂飲食可誘導(dǎo)睪丸生精細(xì)胞凋亡,進(jìn)而導(dǎo)致小鼠睪丸功能損傷,與報(bào)道的研究結(jié)果一致。因此本實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步從ERS的角度探究高脂飲食誘導(dǎo)睪丸生精細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的合成與加工、脂質(zhì)的生物合成、細(xì)胞凋亡和鈣穩(wěn)態(tài)等的重要細(xì)胞器。當(dāng)細(xì)胞受到氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊或脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡等刺激時(shí),就會(huì)引發(fā)細(xì)胞ERS,進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)信號(hào)通路。UPR通過(guò)調(diào)節(jié)下游相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激處理能力,進(jìn)而恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)。在正常生理水平狀態(tài)下,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的PERK、IRE1和ATF6蛋白與分子伴侶蛋白GRP78結(jié)合而處于非激活狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ERS發(fā)生時(shí),GRP78就會(huì)與PERK、IRE1和ATF6蛋白發(fā)生解離,隨后PERK和IRE1通過(guò)自磷酸化而被激活,進(jìn)而激活下游分子;而ATF6則轉(zhuǎn)移至高爾基體進(jìn)而被活化,促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)靶基因的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的維持。PERK信號(hào)通路激活能減少蛋白質(zhì)的合成,IRE1和ATF6信號(hào)通路被激活能增加GRP78的合成,增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)及降解。然而,當(dāng)UPR不能有效緩解持續(xù)過(guò)度的ERS時(shí),則會(huì)啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。caspase-12是結(jié)合在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的天冬氨酸水解酶,在ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用,在ERS過(guò)程中被特異性地剪切為活化的cleaved-caspase-12,并進(jìn)入到細(xì)胞的胞質(zhì)中,激活caspase-3,誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序[12]。

研究表明,持續(xù)過(guò)度的ERS是引發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素,而ERS的發(fā)生又與高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖及糖尿病等代謝性疾病有密切關(guān)聯(lián)[13]。有研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食可明顯增加小鼠肝臟和附睪脂肪組織中GRP78的表達(dá),通過(guò)促進(jìn)GRP78與IRE1和ATF6的解離,激活I(lǐng)RE1和ATF6信號(hào)通路誘導(dǎo)持續(xù)過(guò)度的ERS,導(dǎo)致脂肪積累和胰島素抵抗[14-15]。另有研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食可通過(guò)IRE1和eIF2α信號(hào)通路激活肝細(xì)胞ERS,進(jìn)而誘導(dǎo)大鼠肝細(xì)胞凋亡[8];高脂飲食通過(guò)誘導(dǎo)小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中PERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PERK和ATF4以及IRE1信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-IRE1和XBP1的表達(dá)增加,激活ERS,誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡[16]。本研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織中GRP78表達(dá)明顯增加,同時(shí),IRE1信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-IRE1和XBP1以及ATF6信號(hào)通路相關(guān)蛋白ATF6α的表達(dá)明顯上調(diào),而PERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白p-PERK、p-eIF2α和ATF4的表達(dá)無(wú)明顯變化。然而,Xu等[17]通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn),棕櫚酸可通過(guò)激活PERK和IRE1信號(hào)通路上調(diào)p-PERK、ATF4和p-IRE1的表達(dá)激活ERS,誘導(dǎo)精原細(xì)胞系GC-1細(xì)胞凋亡;Mu等[11]的研究結(jié)果顯示,高脂飲食可通過(guò)增加小鼠睪丸ERS相關(guān)蛋白GRP78,及ATF6和XBP1的表達(dá)誘導(dǎo)睪丸ERS,進(jìn)而導(dǎo)致小鼠生精功能障礙,與本研究結(jié)果相一致,提示,高脂飲食可通過(guò)激活小鼠睪丸組織中IRE1信號(hào)通路和ATF6信號(hào)通路,誘導(dǎo)睪丸ERS。而Xu等[17]體外研究結(jié)果表明,棕櫚酸誘導(dǎo)的脂毒性可激活精原細(xì)胞的PERK信號(hào)通路,誘導(dǎo)ERS,這可能是造模的方式不同所引起的生精細(xì)胞的損傷程度存在差異,因此,還需要后期通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方式更加深入的研究其作用的分子機(jī)制。

綜上所述,高脂飲食可通過(guò)誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡進(jìn)而導(dǎo)致小鼠睪丸功能障礙,與激活I(lǐng)RE1信號(hào)通路和ATF6信號(hào)通路誘導(dǎo)睪丸內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。因此,緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、減輕生殖細(xì)胞凋亡可能是改善高脂飲食誘導(dǎo)的雄性生殖功能障礙的關(guān)鍵。本研究為治療肥胖相關(guān)的雄性生殖功能障礙提供了一定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ),但高脂飲食主要通過(guò)誘導(dǎo)哪一種生精細(xì)胞凋亡,并且抑制UPR中IRE1和ATF6信號(hào)通路是否能改善其凋亡還有待進(jìn)一步研究。