六味地黃湯對UUO大鼠腎組織β-catenin及EMT的影響

王 暉,張海英,高海波,郭金晶,裴 剛,唐 群

(湖南中醫藥大學 1.醫學院、2.藥學院,湖南 長沙 410208)

腎纖維化是各種原因引起的慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)持續發展的相同病理改變,是導致終末期腎病關鍵因素。其主要特征是炎癥細胞浸潤、成纖維細胞的持續大量活化增殖、細胞外基質(extracellular matrix,ECM)含量增多,實質細胞消失,腎組織原有的結構功能喪失[1]。EMT 在腎纖維化的進展中起重要作用,是腎纖維化的重要誘導因素[2]。全世界已有 10%～15% 的人患有 CKD[3],由于 CKD 患病率高,且能增加患心血管疾病的風險[4],成為了日益嚴重的公共衛生問題,但目前仍缺少特異性的治療藥物,因此有效的治療藥物對阻止 CKD 的發展至關重要。

六味地黃湯(Liuwei Dihuang decoction,LWDHD)出自北宋錢乙《小兒藥證直訣》,具有抗炎、抗纖維化的作用,臨床療效明確,但其具體機制尚未明確,課題組前期研究證明LWDHD可上調 ZO-1 的表達,下調N-cadherin、Vimentin 的表達,緩解腎間質纖維化[5]。本研究旨在進一步探討LWDHD是否通過調控 Wnt/β-catenin 信號通路抑制 EMT 干預腎纖維化,以期為其臨床防治 CKD 提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供 48 只 SPF 級 SD 大鼠,雄性,3月齡,體質量(200～220) g,動物許可證號:SCXK(湘)2019-0004,動物質量合格證號 ZS-202110120009。大鼠在湖南中醫藥大學動物中心適應性喂養 1 周后進行實驗。

1.1.2實驗藥物 LWDHD(熟地黃 24 g,山藥12 g,酒萸肉 12 g,牡丹皮 9 g,鹽澤瀉 9 g,茯苓 9 g),批號分別是 2205073、CK22080807、2022071401、NG22081602、2207180122、CK22081501,飲片經兩次煎煮后過濾、濃縮至每 1 mL 水煎液中含有生藥量約為 2 g。依那普利片購自楊子江藥業集團(批號:22030111)。

1.1.3主要試劑 BCA試劑盒(AWB0104a)購自 Abiowell 公司,小鼠單克隆抗體 β-catenin(10023865)、兔單克隆抗體 α-SMA(00118182)、兔單克隆抗體 GAPDH(00113797)、Goat anti-Rabbit lgG(01F220927)均購自 Proteintech公司,兔單克隆抗體 E-cadherin(L22OC02)購自成都正能生物公司。主要儀器 化學發光成像分析儀(721BR17573,美國 Bio-Rad 公司);正置熒光顯微鏡(Axioscope,德國 Carl·Zeiss 公司);酶標儀(Spark 20M,瑞士 Tecan 公司);石蠟切片機(RM2235,徠卡);Pannoramic MIDI 數字玻片掃描系統(3DHISTECH 公司)。

1.2 方法

1.2.1UUO大鼠模型的建立及實驗分組給藥 將體質量(200～220) g的48只雄性SD大鼠隨機分成 Sham 組、UUO 組、LWDHD低、中、高劑量組和依那普利組,每組8只。稱質量后用 1%濃度的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉、消毒,采用俯臥位固定大鼠,在脊柱左側 1.0 cm、髂腰點下約 0.5 cm處作一縱向長 1.5 cm 切口,逐層分離、剝離腎下極被膜,游離出輸尿管后穿兩根 4-0 手術線,一根靠近腎盂,另一根離腎盂 1 cm 左右結扎并從中間剪斷。用注射器吸取含適量慶大霉素的生理鹽水沖洗腹腔、吸凈液體、逐層縫合、涂抹碘伏后放恒溫墊上待大鼠蘇醒,Sham 組除不結扎、不剪斷輸尿管外,其余步驟一致。造模 2 h后[6],根據人鼠等效計量換算并結合前期實驗結果[7]給予LWDHD低、中、高劑量組(3.375、6.75 、13.5 g·kg-1)、依那普利組10 mg·kg-1相應濃度灌胃,UUO、Sham 組用同體積的生理鹽水灌胃。每天1次,連續14 d。

1.2.2標本收集 實驗結束將大鼠腹主動脈放血處死,取出大鼠患側腎臟,用注射器抽取生理鹽水沖洗后,沿矢狀面切開,一部分置于4%多聚甲醛中固定進行后續HE、Masson 染色、免疫組化實驗,另一部分剪取皮質部分裝于凍存管于液氮中保存進行后續 Western blot 檢測。

1.2.3HE、Masson染色 腎臟組織多聚甲醛固定 24 h,75 %、80 %、95 %、100 %乙醇梯度脫水、香柏油覆蓋過夜、二甲苯透明、浸蠟3 h、包埋后置于4 ℃冰箱冷卻,制成蠟塊,厚3 μm切片進行后續染色。

1.2.4免疫組化染色 切片置于60 ℃融蠟箱 1 h,二甲苯脫蠟,常規復水,現配 pH 9.0的 EDTA 抗原修復液,高壓鍋加熱 2 min 進行抗原修復,加入阻斷內源性過氧化物酶阻斷劑,37 ℃ 10 min,PBS 緩沖液洗 3 min×3次,滴加一抗 β-catenin(1 ∶50)、E-cadherin(1 ∶50)、a-SMA(1 ∶50)4 ℃ 冰箱孵育過夜,PBS 洗滌。滴加增強液,室溫孵育 20 min,PBS 洗滌。滴加增強酶標羊抗小鼠/兔IgG聚合物,37 ℃ 20 min,PBS 洗滌。DAB 顯色,浸入蘇木精復染 3 min,分化 3 s、流水返藍 1 h、脫水、透明、封片、閱片。

1.2.5Western blot 檢測 取 40 mg 腎組織加入適量的 RIPA 裂解液和磷酸酶蛋白酶抑制劑放入 4 ℃研磨儀充分研磨后,離心取上清液,配置上樣體系。每孔加 30～40 μg 總蛋白進行 SDS-PAGE 凝膠電泳、轉膜、5% 脫脂牛奶封閉 2 h,加入 β-catenin(1 ∶5 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶4 000)、GAPDH(1 ∶10 000)冰箱孵育過夜,TBST 洗膜 3×10 min,室溫孵二抗(1 ∶15 000)搖 2 h,重復洗膜,滴加顯影液曝光顯影,采用 Image Lab 軟件進行半定量分析。

1.3 統計學方法采用 SPSS 25.0 軟件進行統計分析,多組比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD檢驗;若實驗數據不符合正態性、方差齊性則用 Kruskal-wallis H檢驗。采用 GraphPad 8.0.1 繪制統計圖。

2 結果

2.1 LWDHD對UUO大鼠腎臟組織結構的影響用HE 染色對大鼠腎臟組織進行染色觀察,Sham 組大鼠腎小球結構清楚,腎小管集合管排列緊密規則,腎小管上皮細胞排列規整且基底膜完整;UUO 組中可見腎間質中大量炎細胞浸潤,腎小球硬化,殘存的少量腎小球出現代償性肥大,大量腎小管擴張,上皮細胞扁平或有空泡變性;與 UUO 組相比,不同劑量 LWDHD 組,腎臟病變程度明顯減輕(Fig 1),提示 LWDHD 對大鼠輸尿管梗阻引起的腎纖維化有干預作用。

2.2 LWDHD對UUO大鼠腎臟中膠原纖維沉積的影響通過 Masson 染色對各組大鼠患側腎組織進行染色觀察,與 Sham 組相比,UUO 組大鼠腎間質可見大量染成藍色的膠原纖維,纖維化嚴重;與 UUO 組相比,不同劑量 LWDHD 組腎纖維化程度減輕(Fig 2),表明 LWDHD 干預可減少輸尿管梗阻引起的膠原纖維沉積,抑制腎纖維化的進展。

2.3 LWDHD對大鼠腎組織β-catenin、E-cadherin、α-SMA的影響采用免疫組化(IHC)和 Western blot 法分別對腎組織 β-catenin、E-cadherin、α-SMA 蛋白的表達位置以及表達量進行檢測。IHC 結果顯示:與 Sham 組相比,UUO 組大鼠腎組織中 β-catenin、α-SMA在腎小管上皮細胞胞質內表達增多,E-cadherin 的陽性表達明顯減少(P<0.05);與UUO 組相比,不同劑量 LWDHD 組 β-catenin、α-SMA 陽性表達減少,E-cadherin 陽性表達增加(P<0.05)(Fig 3)。Western blot 實驗結果顯示:與 Sham 組相比,UUO 組大鼠腎組織中 β-catenin、α-SMA 蛋白表達增加,E-cadherin 蛋白表達減少(P<0.05);與 UUO 組相比,不同劑量 LWDHD 組 β-catenin、α-SMA 蛋白表達減少,E-cadherin 蛋白表達增加(P<0.05),該結果與免疫組化染色結果一致。結果提示 LWDHD 明顯降低 UUO 大鼠腎臟中 β-catenin、α-SMA 的蛋白表達水平,升高 E-cadherin 的蛋白表達水平,使患側腎臟的病理變化減輕,對腎纖維化有一定的治療作用(Fig 4)。

Fig 2 Masson staining results of rat renal tissue in each group(×400)

Fig 4 Expression of E-cadherin, β-catenin, α-SMA in rat renal tissue in different groups n=3)

3 討論

腎纖維化主要有兩個方面:一是腎小球硬化;二是腎間質纖維化。腎纖維化的主要特征有腎臟固有結構的損毀、成纖維細胞的激活和增殖,ECM 降解失衡導致在間質過度沉積。活化的肌成纖維細胞是合成 ECM 的主要來源,但大量研究證實在腎臟發生病變的過程中,各種細胞都會發生變化[8],其中腎小管上皮細胞經歷了多種轉化,最終具有肌成纖維樣的細胞表型,這一過程被稱為 EMT,是腎纖維化的重要機制之一[9]。在 EMT 過程中成熟的上皮細胞表型逐漸消失如 E-cadherin 表達逐漸下降,而未成熟的間充質表型明顯如 Vimentin、α-SMA 表達量增加[10]。因此,抑制 EMT 的發生是緩解腎纖維化的重要環節。

EMT 的發生通常與一系列的信號通路協同作用有關,如 Wnt/β-catenin 信號通路、整合素通路、lL-6/STAT3 信號通路等[11],在成熟的腎臟中, Wnt/β-catenin 信號通路保持相對沉默的狀態,當受到損傷時則被異常激活。α-SMA 和 E-cadherin 是 EMT 關鍵標志物。越來越多的研究表明,Wnt/β-catenin 信號通路的激活調控下游 α-SMA、E-cadherin 蛋白的表達,導致 α-SMA 蛋白表達量增加、E-cadherin 蛋白表達量減少,加速 EMT 進程,在腎纖維化的進展中發揮關鍵作用[12],下調 Wnt/β-catenin 信號通路可以抑制 EMT 減輕腎纖維化[13]。因此,抑制 Wnt/β-catenin 信號通路的異常持續激活是治療 CKD 的重要策略。

LWDHD由熟地黃、山藥、山茱萸、澤瀉、牡丹皮、茯苓組成,組方有“三補三瀉”之特點。以熟地黃滋陰補腎,填精益髓為主,輔以山茱萸補養肝腎,并能澀精,山藥補益脾陰,亦能固腎,為“三補”。澤瀉瀉腎濁,丹皮清瀉肝火,茯苓淡滲脾濕且以助山藥益脾,為“三瀉”。從中醫角度探究腎纖維化的病機,即本虛標實,本虛指腎氣虛衰,而標實以濁毒、瘀血為主[14],LWDHD的“三補三瀉”起到既補腎虛,又能化痰(濁)、去瘀、毒。因此,LWDHD在臨床上是用于治療 CKD 的一種有效方劑[15]。本研究首先通過 UUO 手術方法構建大鼠腎纖維化模型,HE 染色結果顯示,與 Sham 組相比,UUO組大鼠腎小球硬化、腎小管擴張,腎間質出現大量炎性細胞,不同劑量的 LWDHD 組均有不同程度的改善。Masson 染色結果顯示,與 Sham 組相比,UUO 組大鼠腎間質增生,藍色的膠原纖維增多,不同劑量的 LWDHD 組腎纖維化程度有不同程度減輕。免疫組化和Western blot實驗結果顯示,與Sham組相比,UUO組大鼠腎組織中 β-catenin 和α-SMA蛋白水平升高,同時E-cadherin 蛋白水平降低;與UUO組相比,不同劑量LWDHD組 β-catenin和α-SMA 蛋白表達水平下調,E-cadherin蛋白表達水平上調。該研究結果表明,LWDHD 在Wnt/β-catenin 信號通路中發揮了抑制作用,進而抑制與纖維化相關的蛋白表達和 EMT 的進展。

綜上所述,本研究初步探討了LWDHD對大鼠腎纖維化的保護作用及作用機制。結果顯示 LWDHD 能改善大鼠的腎纖維化,其機制可能是抑制 Wnt/β-catenin 信號通路的異常持續激活,進而抑制 EMT 的進程緩解腎纖維化。本研究為臨床防治 CKD 提供了新的思路及實驗依據。