朝醫鹿茸大補湯通過WNT5A和TLR4信號通路交互調節氣道重塑的機制研究

李 歡,劉凱月,黃丹丹,劉若白,李良昌,延光海,鄭明昱

(吉林省過敏性常見疾病免疫與靶向研究重點實驗室,延邊大學醫學院,吉林 延吉 133002)

支氣管哮喘(bronchial asthma)屬朝醫學“哮喘”范疇,是以氣道炎癥(airway inflammation)和氣道重塑[1](airway remodeling)為明顯病理標志的呼吸系統疾病。鹿茸大補湯為太陰人哮喘代表方劑,有補肺氣益精血的功用。課題組前期研究顯示鹿茸大補湯能夠通過WNT5A、TLR4等通路調控哮喘相關蛋白的表達[2],但是對通路間是否存在交互作用尚未驗證。故本次利用朝醫鹿茸大補湯對WNT5A和TLR4信號通路交互調節的機制進行研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑

1.1.1細胞 人支氣管上皮細胞(BEAS2B)購買于廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.1.2藥品與試劑 鹿茸10 g,麥冬、薏苡仁各7.5 g,麻黃、山藥、杏仁、天冬、五味子各5 g,購自延吉市北京同仁堂第一分店藥店。按照文獻[3]記錄方法由延邊大學藥學院制作鹿茸大補湯凍干粉,用DMSO溶解后微孔濾膜過濾。凍干粉的主要成分為哌嗪類生物堿、類黃酮、氰苷類、甾體類等,與水煎液HPLC結果一致[4]。anti-WNT5A(貨號bs-1984R)、anti-TLR4(貨號bs-1021R)、anti-NF-κB p65(貨號bs-20160R)、anti-β-Actin(bs-0061R)購自北京博奧森有限公司。

1.1.3儀器 AI600超靈敏化學發光成像儀(美國GE公司);cytation5多功能成像酶標儀箱(美國Bio-Tek公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞的分組 將細胞分為正常組、IL-13組、DMSO組、LRDBT組、DEX組;W+T-組(ICG+TAK-242)、W+T+組(ICG+LPS[5])、W-T+組(FrpHE+LPS)、W-T-N+組(FrpHE+TAK-242、+PMA),以上處理藥物均為100 μmol·L-1,處理后共同給予10 μg·L-1的IL-13刺激細胞24 h。

1.2.2MTT藥物濃度篩選 給予不同濃度的鹿茸大補湯凍干粉,檢測A值。

1.2.3Western blot檢測WNT5A、TLR4和NF-κB蛋白表達 提取細胞蛋白,進行蛋白印跡實驗。

1.2.4免疫熒光(IF)檢測細胞內NF-κB蛋白表達 加入抗體培養,在成像儀下觀察拍照。

2 結果

2.1 MTT藥物濃度篩選與Control組相比,IL-13刺激組細胞的增殖量明顯升高(P<0.01),以2.5 mg·L-1為藥物濃度梯度進行MTT實驗,結果顯示鹿茸大補湯凍干粉濃度為10 mg·L-1時細胞增殖趨于穩定(P<0.01)。

2.2 Western blot 檢測細胞中 WNT5A、TLR4和NF-κB 蛋白水平的表達與Control組相比,W+T-和W-T+組中以上蛋白表達上升;與W+T-和W-T+組相比,W+T+組以上蛋白表達明顯上升。與Control組相比,IL-13組和DMSO組中以上蛋白表達水平上升;與IL-13組和DMSO組相比,LRDBT組和DEX組以上蛋白表達水平下降。

2.3 IF檢測細胞內NF-κB 表達在微孔成像儀下觀察拍照可知,與Control組相比,IL-13組胞內熒光亮度增高,證明NF-κB的表達升高;與IL-13組相比,LRDBT組胞內熒光亮度減弱,證明NF-κB的表達降低,且在核內胞質均有表達。

3 討論

氣道重塑中TLR4和WNT信號通路均可激活NF-κB,另一方面LPS與TLR4結合并激活NF-κB以誘導WNT5A的表達[6]。綜上所述,鹿茸大補湯不僅單獨調控WNT5A或TLR4信號通路,還可以抑制WNT5A和TLR4信號通路交互作用對NF-κB疊加影響,進而改善氣道重塑,為哮喘的治療提供了另外的選擇。