替格瑞洛促進Ⅰ型成骨不全小鼠骨形成的治療研究

趙玉霞 劉義 景亞青 付婷 汪子涵 李光

天津醫科大學基礎醫學院遺傳學系,天津 300070

成骨不全癥(osteogenisis imperfecta,OI)又稱脆骨癥,是一種以骨量減少、骨骼脆性增加和易骨折為主要特征的遺傳性疾病[1]。85%～90%的OI是由COL1A1或COL1A2基因突變所致,表現為常染色體顯性遺傳[2]。1979年,Sillence等[3]根據患者的臨床特征將OI分為Ⅰ～Ⅳ型,其中Ⅰ型表型最輕,但發病率最高,Ⅱ型為胚胎致死型,Ⅲ型反復骨折常導致骨骼畸形,Ⅳ型嚴重程度中等。目前,OI尚無根治療法,臨床治療方案主要包括髓內釘內固定、手術矯形和藥物治療。骨骼是一種處于持續重建過程的動態活性組織,成骨分化和破骨吸收保持動態平衡是其正常結構和功能維持的基礎[4]。研究發現,OI患者或模型小鼠中均存在單位骨形成下降而破骨細胞增多的異常表現[5],是一些藥物、干細胞輸注和基因治療等策略的干預靶標。目前臨床應用最為廣泛的雙膦酸鹽類藥物主要通過抑制破骨細胞活性或誘導破骨細胞凋亡來抑制骨吸收,進而使患者骨密度增加,但這類藥物在體內半衰期長,同時存在胃腸道刺激、高熱、肌痛、乏力等副作用[6]。因此,尋找促進成骨分化、抑制破骨吸收的新藥物對OI患者意義重大。

替格瑞洛(Ticagrelor)是一種可逆的腺苷二磷酸(adenosine diphosphate,ADP)受體P2Y12拮抗劑,可抑制ADP引起的血小板聚集,主要應用于心腦血管疾病的預防和治療[7]。研究表明P2Y12受體不僅表達于血小板和腦組織,還表達于成骨細胞和破骨細胞,并能影響其細胞功能[8-9]。Su等[10]將小鼠的P2Y12受體敲除后發現其破骨細胞活性降低,并可以部分緩解衰老、卵巢摘除等所致的骨丟失,提示阻斷P2Y12受體可抑制病理性骨吸收。Mediero等[11]研究發現,替格瑞洛不僅可以在體外抑制破骨細胞分化并促進成骨細胞分化,還可在顱骨缺損小鼠模型中促進骨形成。OI中也存在成骨細胞骨形成下降和破骨細胞數量增多、活性增強的異常改變[5],替格瑞洛對成骨細胞和破骨細胞功能的調節作用可能會使OI患者獲益,但目前尚無替格瑞洛治療OI的研究報道。本研究采用灌胃的方法對實驗室已經建立的Col1a1雜合突變的Ⅰ型成骨不全小鼠模型(Col1a1+/-365小鼠)進行替格瑞洛干預治療,評估其促進Col1a1+/-365的骨形成的效果,探究其作用機制,為成骨不全的臨床用藥提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物:野生型(WT)C57/BL6雄性小鼠及基因型為Col1a1+/-365的C57/BL6小鼠,8周齡,體質量20～22 g。

1.1.2主要試劑:組織基因組提取試劑盒(美國Biomiga公司);替格瑞洛(上海阿拉丁公司);Trizol試劑(美國Life Technologies公司);cDNA逆轉錄試劑盒(美國Promega公司);熒光定量PCR試劑盒(德國Qiagen公司);HE染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);抗酒石酸酸性磷酸酶染色液(北京索萊寶科技有限公司)。

1.1.3主要儀器:低溫離心機(德國Eppendorf公司);Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR儀(德國Qiagen公司);ABI Veriti PCR儀(美國Applied biosystems公司);科研級光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司);Skyscan 1276 Micro-CT分析儀(德國Bruker公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1Col1a1+/-365小鼠基因型鑒定:新生雄性小鼠10 d時剪取鼠尾0.3 cm提取鼠尾組織細胞DNA,以鼠尾DNA為模板進行PCR反應,Col1a1的擴增引物序列為:Forward:5’-CACCTACTGCGTAGGA GCCC-3’,Reverse:5’-CCCAACAGCCAGACTC TTCA-3’)。PCR反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,設置35個循環;72 ℃延伸10 min。

1.2.2實驗動物分組:實驗分WT對照組、DMSO對照組、替格瑞洛治療組,每組各6只。DMSO對照組、替格瑞洛治療組小鼠為Col1a1+/-365小鼠。WT對照組正常飼養,DMSO對照組給予0.2 mL含同劑量DMSO的玉米油灌胃,替格瑞洛治療組給予0.2 mL含替格瑞洛的玉米油灌胃,給藥劑量為2 mg/(kg·d),藥物干預時間為10周。

1.2.3Micro-CT檢測股骨微觀結構的改變:將三組小鼠的股骨浸泡于4%多聚甲醛中固定24 h,選用動物成像專用的Skyscan 1276 Micro-CT分析儀對小鼠的股骨進行掃描,掃描結束后用CTAn1.15.4軟件對其進行三維立體重構,并計算骨體積分數(percent bone volume,BV/TV,%)、骨小梁數量(trabecular number,Tb.N,n/mm)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th,mm)和骨小梁模式因子(trabecular bone pattern factor,Tb.Pf,1/mm)等參數。

1.2.4HE、TRAP染色:將各組小鼠股骨浸泡于4%的甲醛中固定3 d,3 d后將股骨浸泡于脫鈣液中進行脫鈣,每3 d換一次脫鈣液,脫鈣21 d,直至股骨變軟后進行脫水處理,完成后將股骨組織浸于融化的石蠟中進行包埋,切片機切片,厚度約3 μm。常規HE染色、TRAP染色,顯微鏡下觀察股骨骨小梁和破骨細胞的變化。

1.2.5破骨特異基因的表達檢測:采用Trizol法提取各組股骨組織中的RNA,采用cDNA逆轉錄試劑盒將提取的RNA逆轉為cDNA,使用SYBR Green qPCR Mix于實時熒光定量PCR儀進行PCR擴增反應,檢測破骨細胞特異基因Mmp9、Ctsk和Nfatc1的表達水平,引物序列分別為:Gapdh(forward:5’-CATCACTGCCACCCAGAAGACTG-3’;reverse:5’-ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAG-3’);Mmp9(forward:5’-GCAGAGGCATACTTGTACCG-3’;reverse:5’-TGATGTTATGATGGTCCCACTTG-3’);Ctsk(forward:5’-AATA CCTCCCTCTCGATCCTACA-3’;reverse:5’-TGGTTCTTGACTGGAGTAACGTA-3’);Nfatc1(forward:5’-GGAGCGGAGAAACTTT GCG-3’;reverse:5’-GTGACACTAGGGGACACAT AACT-3’)。實時定量PCR的反應條件:95 ℃預變性5 min;95 ℃變性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸20 s(40個循環)。實驗以Gapdh作為內參,采用2-ΔΔCt法進行相對定量分析。

1.3 統計學分析

應用SPSS 20.0軟件對數據進行分析和處理,研究數據使用均數±標準差表示,兩組間比較采用獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Col1a1+/-365小鼠基因型鑒定

鼠尾細胞DNA PCR產物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳,WT小鼠PCR擴增產物為1 623 bp,Col1a1+/-365小鼠PCR擴增產物為1 623 bp和594 bp,圖1中1和2號小鼠為Col1a1+/-365小鼠,3～7號小鼠為野生型小鼠。

圖1 Col1a1+/-365小鼠基因型鑒定

2.2 替格瑞洛對小鼠股骨微觀結構的影響

筆者前期研究顯示,與WT小鼠相比,Col1a1+/-365小鼠Ⅰ型膠原表達下降、皮質骨和松質骨骨量均明顯減少,骨小梁數量和厚度減少、間隙增寬,皮質骨變薄[5]。Micro-CT結果顯示,與WT組比較,DMSO對照組小鼠BV/TV、Tb.N、和Tb.Th均顯著下降(*P<0.05,**P<0.01),而Tb.Pf明顯增高(***P<0.001),與之前的報道一致。與DMSO對照組比較,Ticagrelor治療組BV/TV、Tb.N和Tb.Th均顯著增高(*P<0.05),而Tb.Pf明顯降低(*P<0.05)。而Ticagrelor治療組小鼠與WT組小鼠BV/TV、Tb.N和Tb.Th差異無統計學意義(P>0.05)。這些結果說明Ticagrelor治療后Col1a1+/-365小鼠松質骨骨量增加、骨小梁參數明顯改善,結果見圖2。

2.3 替格瑞洛對小鼠骨小梁形態的影響

替格瑞洛治療后對股骨組織切片進行HE染色,結果顯示,與DMSO對照組相比,Ticagrelor治療組小鼠骨小梁數量增多、面積增大(圖3A)。使用image pro-plus 6軟件對骨小梁的面積進行測量,結果顯示,Ticagrelor治療組小鼠的骨小梁面積與WT對照組小鼠無顯著差異(P>0.05);與DMSO對照組相比,Ticagrelor治療組小鼠骨小梁面積明顯增多(*P<0.05),說明Ticagrelor可以有效地促進Col1a1+/-365小鼠股骨松質骨形成,結果見圖3B。

2.4 替格瑞洛對Col1a1+/-365小鼠破骨細胞數量的影響

替格瑞洛治療后對小鼠股骨組織切片進行Trap染色,觀察其破骨細胞分布情況。結果顯示,與WT組小鼠比較,DMSO對照組Col1a1+/-365小鼠的破骨細胞數量顯著增加(*P<0.05),與筆者之前報道的Col1a1+/-365小鼠破骨細胞明顯增多一致。雖然Ticagrelor治療的Col1a1+/-365小鼠破骨細胞數量仍明顯高于WT組小鼠,但與DMSO對照組相比較,Ticagrelor治療組Col1a1+/-365小鼠破骨細胞顯著減少(*P<0.05),說明Ticagrelor可以有效抑制Col1a1+/-365小鼠破骨細胞的形成,有利于骨量的累積,結果見圖4。

圖4 Ticagrelor對Col1a1+/-365小鼠股骨破骨細胞的影響

2.5 替格瑞洛對小鼠破骨細胞特異基因的影響

為探究替格瑞洛抑制破骨細胞生成的潛在機制,采用實時定量PCR法檢測股骨組織的破骨細胞特異基因Mmp9、Ctsk和Nfatc1的表達水平。結果顯示,與WT組或DMSO對照組相比,Ticagrelor治療組Mmp9、Ctsk、Nfatc1的表達量均顯著降低(*P<0.05),表明替格瑞洛可以抑制Col1a1+/-365小鼠破骨細胞特異基因的表達,進而抑制破骨細胞的分化,減少骨吸收,結果見圖5。

圖5 Ticagrelor對Col1a1+/-365小鼠股骨破骨細胞特異性基因的影響

3 討論

OI是較常見的遺傳性骨病之一,以骨量降低、骨脆性增加和反復骨折為主要特征[12-13],在新生兒中患病率為1/150 000～200 000[14]。OI常常于幼年起病,輕微創傷后即可發生骨折,反復骨折常導致骨畸形,致殘率較高,嚴重影響患者的生活質量[15]。研究表明,破骨細胞骨吸收與成骨細胞骨形成的相對平衡對維持骨穩態至關重要。Ⅰ型成骨不全由COL1A1基因突變導致的Ⅰ型膠原表達降低引起,患者主要表現為骨量下降和骨脆性增加,其骨形成減少、骨吸收增加是骨量下降的重要原因,但相關機制尚不明確。尋找促進成骨分化和(或)抑制破骨吸收的臨床藥物是治療OI的主要方向之一。

作為血小板表面主要的ADP受體,P2Y12可放大血小板的活化信號,其拮抗劑如氯吡格雷(Clopidogrel)和普拉格雷(Prasugrel)等藥物已被廣泛應用于臨床心肌梗死和急性冠脈綜合征的治療[16]。近年來,有研究顯示P2Y12也分布在成骨細胞和破骨細胞表面,而且參與成骨和破骨活動的調控。Su等[10]的報道顯示P2Y12在破骨分化的過程中發揮重要作用,敲除P2Y12受體的P2ry12-/-小鼠破骨細胞活性減弱并可防止衰老和關節炎等引起的骨丟失。同時研究顯示氯吡格雷可以防止骨腫瘤和卵巢去勢引起的骨丟失[10]。這些研究提示,P2Y12受體拮抗劑可通過對骨形成和骨吸收的調節發揮骨保護作用。

替格瑞洛是新一代的P2Y12抑制劑,其在成骨分化和破骨吸收方面發揮的作用也引發了研究者的關注。2016年,Mediero等[11]在體外誘導小鼠骨髓細胞破骨分化過程中分別加入不同濃度的替格瑞洛進行干預,結果發現干預組的破骨細胞數明顯低于對照組,證明替格瑞洛可以在體外抑制破骨細胞的形成。為了進一步研究替格瑞洛在體內的作用,研究者將含替格瑞洛的羥基磷灰石/磷酸三鈣納米材料植入顱骨缺損的小鼠模型,4周后發現小鼠顱骨新生骨體積明顯多于單純羥基磷灰石/磷酸三鈣植入組,證明替格瑞洛可以有效地促進骨形成。然而,目前尚無替格瑞洛治療成骨不全的相關研究和報道。

因此,本實驗選用替格瑞洛對模擬Ⅰ型成骨不全的小鼠(Col1a1+/-365)進行了治療,采用Micro-CT和HE染色等方法對其促成骨作用進行了檢測,結果顯示與DMSO對照組相比,替格瑞洛治療組Col1a1+/-365小鼠股骨的BV/TV、Tb.N、Tb.Th增高,Tb.Pf降低,表明替格瑞洛可以增加Col1a1+/-365小鼠的骨量、骨小梁數目、骨小梁厚度和骨小梁面積,有效改善Col1a1+/-365小鼠骨微觀結構,促進其骨生成。為了探討替格瑞洛促進骨生成的作用機制,本實驗采用Trap染色觀察了3組小鼠破骨細胞數量的變化,結果顯示替格瑞洛治療組小鼠破骨細胞數量顯著減少,說明替格瑞洛有效地抑制了Col1a1+/-365破骨細胞的生成。研究表明,破骨細胞分化成熟受到核因子受體活化因子配體-核因子受體活化因子-骨保護素(RANKL-RANK-OPG)信號通路等多條信號通路的精準調控,Nfatc1是RANKL-RANK-OPG通路中調節破骨細胞分化的關鍵轉錄因子,當Nfatc1被激活后便從細胞質轉移至細胞核內,并與C-Fos、C-Jun等轉錄因子共同啟動轉錄調控,誘導破骨分化特異基因Mmp9、Ctsk等的表達,促使單核細胞或破骨前體細胞向成熟的破骨細胞分化[17-19]。因此,本實驗進一步對Mmp9、Ctsk、Nfatc1進行了表達量的檢測和分析,結果顯示替格瑞洛治療組Col1a1+/-365小鼠股骨Mmp9、Ctsk、Nfatc1的表達量明顯降低,表明替格瑞洛可能通過RANKL-RANK-OPG信號通路抑制Col1a1+/-365小鼠的破骨分化與生成。

綜上所述,替格瑞洛可以有效改善Col1a1+/-365小鼠的股骨微觀結構,促進骨形成,其機制可能與抑制破骨細胞分化有關。替格瑞洛具有治療Ⅰ型成骨不全的潛在價值,但此研究目前處于初步探索階段,具體作用機制仍需進一步深入探究。