異藤黃酚對急性淋巴細胞白血病Jurkat細胞增殖和凋亡的影響及機制*

劉琴,楊坤,牛振鵬,韋學耐,宋晶睿,饒青,黃裕兵,苑春茂,李艷梅***

(1.貴州醫科大學 藥學院,貴州 貴陽 550004; 2.貴州省天然產物研究中心,貴州 貴陽 550014; 3.貴州醫科大學 省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室,貴州 貴陽 550014; 4.貴州醫科大學 基礎醫學院,貴州 貴陽 550004)

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)是一種侵襲性血液系統惡性疾病,是最常見的兒科惡性腫瘤,也是導致兒童死亡的主要病因[1-2]。目前,臨床上用于治療ALL的藥物主要有長春新堿、類固醇激素及蒽環類藥物等[3]。在過去,ALL是一種難治性的血液系統惡性疾病,近年來隨著個體化治療的普及,其治愈率有所提高,但復發和化療耐藥仍然是臨床治療ALL的主要難題[4]。因此,研發新型抗ALL的藥物對臨床治療意義重大。來源于藤黃科植物的化合物具有結構新穎及生物活性廣泛的特點,近年來成為植物化學及藥理學研究的熱點之一[5]。木竹子(GarciniamultifloraChamp.ex Benth.)又稱多花山竹子,屬于藤黃科藤黃屬植物,是一種傳統中藥材,在中醫治療中,常以果實入藥,味甘、性涼,具有清熱、生津功效[6]。異藤黃酚(isogarcinol,ISO)是從木竹子中提取分離得到的天然小分子化合物,有研究報道ISO具有抗菌、抗炎及抗腫瘤活性[7-10],但對ALL Jurkat細胞的影響未見相關報道。因此,本研究主要探討ISO對Jurkat細胞增殖及凋亡的影響,并進一步探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 人ALL Jurkat細胞和人正常肝細胞HL-7702購買于美國細胞培養物收藏中心(American Type Culture Collection,ATCC),由貴州省天然產物研究中心保存。

1.1.2主要試劑 二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide,DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司,三聯夜(十二烷基硫酸鈉50 g溶解于適量雙蒸水,加異丁醇25 mL和濃鹽酸 0.5 mL,再加雙蒸水至500 mL配置而成),洛斯維·帕克紀念研究所(Roswell Park Memorial Institute,RPMI)1640培養液(美國Gibco公司),胎牛血清(美國BI公司),線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)檢測試劑盒和Hoechst 33258染色試劑盒(江蘇碧云天生物公司),β-肌動蛋白(β-actin)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartate protease 3,Caspase3)、剪切的Caspase3(Cleaved Caspase3,Cleaved-caspase3)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9(cysteine aspartate protease 9,Caspase9)、剪切的Caspase9(Cleaved Caspase9,Cleaved-caspase9)、凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1,Apaf-1)、細胞色素C(cytochrome c,Cytc)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylated PI3K,p-PI3K)、重組人BH3結構域凋亡誘導蛋白(recombinant human BH3 domain apoptosis-inducing protein,Bid)、截斷的Bid(truncated Bid,t-Bid)、磷酸化的信號轉導和轉錄激活因子-3(phosphorylated signal Transducer and Activator of Transcription 3,p-STAT3)、Janus激酶2(janus kinase 2,JAK2)、磷酸化JAK2(phosphorylated JAK2,p-JAK2)、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(polyadenosine diphosphate ribose polymerase,PARP)、剪切的PARP(cleaved PARP,Cleaved-PARP)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,p38)一抗及異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標記的二抗(美國CST公司),磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)一抗(美國SAB公司),細胞骨髓瘤病毒癌基因(cellular myelocytomatosis viral oncogene,c-Myc;英國Abcam公司),信號轉導和轉錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3;杭州華安生物技術有限公司)。

1.1.3主要儀器 Synergy2 酶標儀(美國Biotek公司),流式細胞儀(杭州艾森生物有限公司),倒置熒光顯微鏡(德國ZEISS公司),凝膠電泳儀(美國BIO-RAD公司),Odyssey CLX 紅外成像系統(美國LI-COR公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養 ALL Jurkat細胞使用含5%血清的RPMI 1640培養基,人正常肝細胞HL-7702使用含5%血清的DMEM培養基,于37 ℃、5%的二氧化碳培養箱中培養。

1.2.2MTT法檢測細胞活力 采用MTT法檢測ISO對Jurkat細胞活力的影響,以人正常肝細胞HL-7702作為毒性對照。取“1.2.1”項下對數生長期的Jurkat細胞以1×104個/孔接種于96孔板,取“1.2.1”項下對數生長期的HL-7702細胞以8 000個/孔接種于96孔板,以DMSO為空白對照,用設定濃度的ISO(10、15、20及25 μmol/L)處理Jurkat細胞和HL-7702細胞24、48及72 h,加MTT(10 μL/孔)于37 ℃培養箱避光孵育4 h,再加三聯夜(100 μL/孔)置于37 ℃培養箱孵育過夜,酶標儀于570 nm波長處測定各孔的光密度(optical density,OD)值,計算不同時間點的細胞存活率。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 取“1.2.1”項下對數生長期的Jurkat細胞,按5×105個/孔接種于6孔板,以DMSO為空白對照,用設定濃度的ISO(10、15及20 μmol/L)處理Jurkat細胞24、48 h,1 500 r/min離心3 min,收集細胞,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)洗滌,加1×Binding Buffer 50 μL重懸細胞,分別加Annexin V-FITC 和碘化丙啶(propidium iodide,PI )2.5 μL,室溫避光染色15 min,用流式細胞儀檢測細胞的凋亡。

1.2.4Hoechst 33258染色驗證ISO對Jurkat細胞凋亡的影響 取“1.2.1”項下對數生長期的Jurkat細胞(5×105個/孔)接種于6孔板,分組及處理同“1.2.3”,24 h后收集細胞,PBS洗滌,加0.5 mL試劑盒中的固定液固定細胞10 min,1 500 r/min離心3 min,去固定液,PBS洗滌,加 Hoechst 33258染色液0.5 mL,避光染色5 min,置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5MMP檢測試劑盒(mitochondrial membrane potential assay kit,JC-1)檢測ISO對Jurkat細胞MMP的影響 取“1.2.1”項下對數生長期的Jurkat細胞(5×105個/孔)接種于6孔板,分組及處理同“1.2.3”,24 h后收集細胞,PBS洗滌,加培養液和JC-1染色工作液0.5 mL,混勻,置于細胞培養箱中孵育20 min,1 500 r/min離心3 min,用1×JC-1染色緩沖液洗滌細胞3次,加適量1×JC-1染色緩沖液重懸細胞,于熒光顯微鏡下觀察產生綠色熒光或紅色熒光的細胞占比。

1.2.6RNA高通量測序(RNAsequencing,RNA-seq)實驗 取“1.2.1”項下對數生長期的Jurkat細胞,按1.5×106個/孔接種于細胞培養皿,分別用DMSO、ISO處理Jurkat細胞24 h,1 500 r/min離心5 min,收集細胞,加Trizol 裂解后送樣至武漢華大基因測序公司進行測序分析。

1.2.7Western blot 檢測相關蛋白的表達 取“1.2.1”項下對數生長期的Jurkat細胞(1.5×106個/皿)接種于細胞培養皿,分組及處理同“1.2.3”,24 h后收集細胞,加適量的細胞裂解液于冰上裂解45 min,4 ℃下12 000 r/min離心15 min,取上清液(蛋白溶液),BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,將蛋白溶液與5×Loading Buffer以體積4∶1比例混勻,100 ℃金屬浴變性5 min,置于-80 ℃保存備用。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)分離蛋白50 μg,用濕轉法將蛋白轉移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,室溫3%牛血清白蛋白溶液封閉1 h,4 ℃下與Caspase3、Cleaved-caspase3、Caspase9、Cleaved-caspase9、PARP、Cleaved-PARP、Apaf-1、Cytc、Akt、p-Akt、PI3K、p-PI3K、p38、p-p38、STAT3、p-STAT3、JAK2、p-JAK2及c-Myc相應一抗孵育過夜,1倍三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(tris buffered saline,TBS)洗滌,室溫下與帶熒光的兔二抗孵育2 h,用紅外成像儀對膜進行掃描。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 細胞增殖

MTT檢測結果顯示(圖1A和1B),ISO能以時間-濃度依賴方式使Jurkat細胞活力下降(P<0.05),但對HL-7702細胞活力的影響較小;與DMSO組相比,10、15、20及25 μmol/L ISO組Jurkat細胞活力下降(P<0.05),且具有時間依賴性;與DMSO組相比,10、15、20及25 μmol/L ISO組HL-7702細胞活力無變化(P>0.05)。光學顯微鏡下觀察到ISO處理48 h后,能使Jurkat細胞數量明顯減少,且細胞趨于碎片化,但對HL-7702細胞形態和數量的影響較小(圖1C),提示ISO可能對Jurkat細胞具有選擇性。

注：A為Jurkat細胞存活率,B為HL-7702細胞存活率,C為ISO處理Jurkat細胞和HL-7702細胞48 h后,明視野下的細胞數量及形態(20×);(1)與DMSO組比較,P<0.05。

2.2 細胞凋亡

為了探究ISO能否誘導Jurkat細胞凋亡,采用流式細胞術檢測結果如圖2 A和2B所示,ISO處理Jurkat細胞24 h和48 h后,與DMSO組相比,10、15 及20 μmol/L ISO組Jurkat細胞凋亡率升高(P<0.05),且具有時間依賴性;Hoechst 33258染色進一步驗證ISO對Jurkat 細胞凋亡的影響,結果顯示(圖2 C),與DMSO組相比,ISO處理Jurkat細胞24 h,熒光顯微鏡下觀察到呈現亮藍色熒光的細胞數逐漸增多,進一步表明ISO可誘導Jurkat細胞發生凋亡。

注：A為流式細胞術檢測Jurkat細胞的凋亡率(顏色越紅表示細胞密度越大),B為凋亡率統計分析,C為Hoechst 33258 染色結果(20×,亮藍色熒光越多表示凋亡細胞越多);(1)與DMSO組比較,P<0.05。

2.3 MMP及凋亡相關蛋白的表達

MMP檢測試劑盒JC-1分析ISO對Jurkat細胞MMP的影響,結果顯示,ISO處理 Jurkat細胞24 h后,熒光顯微鏡下觀察到產生紅色熒光的細胞數逐漸減少,而產生綠色熒光的細胞數逐漸增多,提示MMP下降;Western blot結果顯示,ISO 處理 Jurkat 細胞24 h后,與DMSO組相比,10、15及20 μmol/L ISO組Jurkat細胞Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP、t-Bid、Apaf-1及Cytc的表達增加(P<0.05),Caspase-3、Caspase-9、Bid及PARP的表達無變化(P>0.05),提示ISO通過激活線粒體凋亡途徑誘導Jurkat細胞凋亡。見圖3。

注：A為JC-1染色結果(20×,紅色熒光表示細胞MMP正常,綠色熒光表示細胞MMP下降),B為Western blot檢測結果(綠色熒光表示蛋白顯影條帶,綠色熒光越強,蛋白表達量越高),C、D分別為Caspase3、Cleaved-caspase3、Caspase9、Cleaved-caspase9、PARP、Cleaved-PARP及Bid、t-Bid、Cytc、Apaf-1蛋白的相對表達量;(1)與DMSO組比較,P<0.05。

2.4 ISO對JAK2/STAT3/c-Myc信號通路的影響

Western blot檢測ISO對JAK2/STAT3/c-Myc途徑相關蛋白表達水平的影響,結果如圖4 所示,與DMSO組相比,10、15及20 μmol/L ISO組Jurkat 細胞中p-JAK2、p-STAT3及c-Myc的表達下降(P<0.05),提示ISO以濃度依賴方式下調了p-JAK2、p-STAT3及c-Myc的水平,但JAK2和STAT3的表達無變化(P>0.05),則提示ISO可能通過抑制JAK2/STAT3/c-Myc途徑誘導Jurkat細胞凋亡進而抑制其增殖。

注：A為Western blot檢測各蛋白的表達結果(綠色熒光表示蛋白顯影條帶,綠色熒光越強,蛋白表達量越高),B為各蛋白表達的定量結果;(1)與DMSO組比較,P<0.05。

2.5 ISO對PI3K/Akt、p38 MAPK信號通路的影響

RNAseq分析結果如圖5A所示,與DMSO組相比,ISO處理Jurkat細胞24 h后,使299個基因上調,57個基因下調;通過Kegg-Pathway富集分析發現,ISO主要影響了Jurkat細胞中MAPK及PI3K/Akt等信號途徑(圖5B);基于上述結果,采用Western blot 檢測ISO對Jurkat細胞PI3K/Akt和MAPK信號通路相關蛋白表達的影響,結果如圖5 C和5D所示,與DMSO組相比,10、15及20 μmol/L ISO組Jurkat細胞中p-p38的表達上調(P<0.05),p-PI3K、p-Akt的表達下調(P<0.05),提示ISO可能通過抑制PI3K/Akt通路,激活p38 MAPK通路,促進Jurkat細胞凋亡進而抑制其增殖。

注：A為差異表達基因,B為Kegg-Pathway富集分析結果(顏色越紅代表富集相關性越大,顏色越藍代表富集相關性越小,圈的大小代表基因數的多少,圈越大,基因數越多),C為Western blot檢測各蛋白表達的結果(綠色熒光表示蛋白顯影條帶,綠色熒光越強,蛋白表達量越高),D為各蛋白相對表達量的定量結果統計分析;(1)與DMSO組比較,P<0.05。

3 討論

ALL是由淋巴祖細胞在骨髓內異常增生和聚集導致的一種惡性腫瘤[11],盡管目前治療已取得重大進展,但仍有部分患者面臨復發和預后不良[12]。因此,尋找新型抗ALL藥物對臨床ALL的治療意義重大。天然產物具有結構新穎、多靶點作用的特點,是抗腫瘤藥物研發的寶庫[13]。本研究結果表明,源于木竹子的天然小分子化合物ISO能明顯抑制Jurkat細胞增殖并誘導其凋亡,但對人正常肝細胞HL-7702的影響較小,提示ISO可能是一個低毒高效的天然小分子化合物,具有開發為抗ALL藥物的潛力。

細胞凋亡是一個細胞程序性死亡的過程,對維持機體的穩態具有重要作用,凋亡機制缺陷會促進癌癥的發生[14]。細胞凋亡主要有3條途徑:內質網途徑、線粒體途徑及死亡受體途徑[15-16]。最經典的凋亡途徑是線粒體介導的細胞凋亡,MMP的下降直接導致線粒體膜的通透性增大,使Cytc釋放到胞質并與Apaf-1結合形成凋亡復合體,啟動Caspase級聯進而導致細胞凋亡[17]。Caspase家族成員在細胞凋亡過程中具有重要作用,Caspase9被凋亡復合體激活后,將信號傳遞給Caspase3,其活化后切割PARP進而導致細胞凋亡[18]。本研究結果顯示,ISO能上調Cleaved-caspase3、Cleaved-caspase9、Cleaved-PARP、t-Bid、Apaf-1及Cytc的表達,激活線粒體凋亡途徑,誘導Jurkat細胞凋亡。

JAK2/STAT3信號通路參與調節細胞增殖、分化、凋亡等多種生物過程[19],該通路的過度激活參與了白血病、肝癌、乳腺癌及胰腺癌等多種癌癥的發生發展[20]。c-Myc是一個重要的轉錄因子,其在多種腫瘤細胞中高表達[21],c-Myc的抑制能明顯抑制腫瘤細胞的增殖[22]。越來越多的研究報道,JAK2/STAT3/c-Myc信號通路的異常激活在多種血液系統惡性腫瘤中被認為是支持腫瘤細胞存活、增殖及代謝的關鍵因素,抑制JAK2/STAT3/c-Myc途徑可以抑制T細胞ALL(T-ALL)細胞的增殖并誘導其凋亡[23]。本研究結果表明,天然小分子化合物ISO可抑制Jurkat細胞中JAK2/STAT3/c-Myc信號通路相關蛋白p-STAT3、p-JAK2及c-Myc的表達。

p38 MAPK途徑在細胞凋亡及炎癥的調節中具有重要作用,激活該通路可以誘導腫瘤細胞的凋亡。研究表明,激活p38 MAPK可以誘導人ALL細胞系Jurkat和Nalm-6的凋亡并抑制其增殖,也可以誘導人肝癌細胞HepG2發生凋亡[24]。PI3K/Akt信號通路在調控細胞的增殖和存活中起著重要作用,許多研究表明,PI3K/Akt信號通路的過度激活與癌癥的發生密切相關,且是T-ALL的特征之一[25]。本研究通過RNAseq分析及Western blot檢測后結果表明,ISO影響Jurkat細胞中p38 MAPK和PI3K/Akt信號通路相關蛋白p-p38、p-PI3K和p-Akt的表達。

綜上所述,本研究表明天然小分子化合物ISO能抑制Jurkat細胞增殖,并通過激活線粒體凋亡途徑誘導其凋亡,其機制可能與PI3K/Akt及JAK2/STAT3/c-Myc途徑的抑制及p38 MAPK通路的激活有關。但本研究僅對ISO的體外抗白血病活性進行了初步探討,后續研究將利用基因敲除及過表達技術,尋找ISO抗ALL的潛在靶點,并建立ALL動物模型,進一步驗證該化合物的體內活性,明確其抗ALL的效果及作用機制,為ISO開發為抗ALL藥物提供實驗依據和科學理論基礎。