丹參酮ⅡA對細菌性腦膜炎大鼠海馬區損傷的作用及機制*

李玉美,余資江,羅時鵬,楊丹,肖朝倫,孫寶飛,黃濤,李琳,劉來兵

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 人體解剖教研室,貴州 貴陽 550025; 2.貴州醫科大學附屬醫院 神經外科,貴州 貴陽 550004)

細菌性腦膜炎(bacterial meningitis,BM)是一種嚴重的中樞神經系統感染性疾病,感染導致顱內壓升高進而發生腦疝等危及患者生命[1]。隨著醫學的發展BM患者病死和致殘率雖有所下降,但50%以上的感染患者因神經元損傷而遺留智力、學習及記憶能力等認知功能障礙的后遺癥[2]。廣泛耐藥的鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii,A.baumannii)比其他不動桿菌有更強的致病能力,且致死亡率高達35%[3-4],因此探索傳統中藥對A.baumannii感染引起的BM的診治具有研究價值。氧化還原失衡是BM造成腦損傷的重要原因,丹參酮ⅡA屬于丹參酮類,作為一種具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤和激素樣作用的傳統中藥,廣泛運用于心血管、代謝、癌癥、神經退行性等疾病的治療[5-8]。Zhou 等[9]證實丹參酮ⅡA可抑制高遷移率族蛋白1(high mobility group box protein 1,HMGB1)的表達而減輕敗血癥對機體的損傷。因此,探索丹參酮 Ⅱ A在BM治療中的作用具有一定的研究價值。本研究以BM發生后致海馬區損傷表現認知功能障礙為切入點,利用傳統中藥制劑副作用小的優勢,探討丹參酮ⅡA具體的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 成年雄性健康清潔SD大鼠40只,3～4月齡,250～300 g,由學校實驗動物中心提供[合格證號SYXK(黔)2018-0001]。

1.1.2菌株與細胞株來源A.baumannii標準質控菌株(17978)、小鼠海馬神經元細胞(HT-22)均購于美國模式菌種收集中心(American Type Culture Collection,ATCC)。

1.1.3主要試劑 兔抗HMGB1、基質金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinase,MMP9) 多克隆抗體購自北京博奧森、NF-кB(p-p50,p-p65)多克隆抗體購自美國Abcam,白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、IL-10、腫瘤壞死因子β(tumor necrosis factor-β,TNF-β)ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特、吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidinedithiocarbamic acid,PDTC)由蘇州碧云天廠家提供,RT-PCR提取試劑盒購自日本寶生物,逆轉錄試劑盒購自北京天根。

1.2 研究方法

1.2.1A.baumannii液的制備A.baumannii(17978)在平板培養過夜復蘇,再挑選單菌落在含心腦浸液的瓊脂平板培養過夜,最后輕移至肉湯37 ℃搖床搖16～18 h,調整細菌數,使其OD為0.1,計數菌落后建模備用。

1.2.2動物模型分組 健康、清潔級的SD雄性大鼠40只,分為正常組(normal control group,NC組)、A.baumannii感染組(bacterial meningitis group,BM組)、生理鹽水干預組(bacterial meningitis+ normal saline,BM+NS組)及丹參酮ⅡA干預組(bacterial meningitis + tanshinoneⅡA,BM+TS組),正常組不做任何處理,后3組先采用環磷酰胺(45 mg/kg)和地塞米松(90 mg/kg)腹腔聯合注射構建免疫受損動物模型后再開顱構建BM模型,具體步驟如下:將大鼠固定在腦立體定位儀下,沿失狀縫切開皮膚,以前囟為坐標零點,向后0.5 mm、右側1.5 mm,用0.9 mm直徑顱骨鉆頭打開顱骨,微量注射器進針3.5 mm后緩慢注入10 μL臺盼藍溶液以確定側腦室位置,以此方法將15 μL、濃度為1×1011個/L濃度的A.baumannii懸液注入后3組大鼠的側腦室構建BM模型;后2組菌液注入完成后立即同部位注入丹參酮ⅡA或生理鹽水3 mg/kg體質量(每只動物注射劑量為0.75～0.80 mg)。術后無菌環境飼養,通過行為學、病理學檢測等判定模型是否構建成功。

1.2.3Morris 水迷宮檢測大鼠學習與記憶能力 自建模第2天開始連續3 d采用定向航行和空間探索2種方式檢測大鼠學習與記憶能力變化。空間探索:將大鼠頭向池壁放入水池,記錄每只大鼠到達逃逸平臺的時間即為逃逸潛伏期。若120 s大鼠未能找到平臺,則引導大鼠到達平臺,潛伏期記為 120 s;定向航行:連續3 d的定位航行實驗后撤去逃逸平臺,記錄大鼠在120 s 內找到目標象限所花時間及進入目標象限的次數,以此檢測海馬區功能受損對其學習記憶能力的影響。

1.2.4尼氏染色檢測腦組織海馬區域的病理改變 在感染第7天時處死動物,開顱取出海馬,去除周圍的血管及結締組織等,部分組織于4%中性甲醛固定后包埋。腦組織切片常規脫蠟、梯度酒精入水,1%甲苯胺藍染色,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片,鏡下觀察海馬區神經細胞的形態及排列變化。

1.2.5ELISA檢測血清中IL-6、IL-10、TNF-β含量 在感染第7天時處死動物,收集2 mL股動脈血液樣本,按照IL-6、IL-10、TNF-β酶聯免疫試劑盒說明測定其表達。具體方法:加血清于反應孔中孵育,同時設有空白孔和標準品孔,各反應孔中加入終止液混勻后測OD值檢測各組炎癥因子的表達變化。

1.2.6檢測HMGB1、NF-кB(p-p65)含量 在感染第7天時處死動物,按每100 mg新鮮腦組織加入 Trizol試劑1 mL于勻漿器中完全磨碎。根據文獻合成NF-кB/P65引物序列(上游為ACAACCCCTTCCAAGTTCCT,下游為TGGTCCCGTGAAATACACCT,擴增溫度56 ℃)和HMGB1引物序列(上游為TATGGCAAAAGCGGACAAG,下游為CTTCGCAACATCAC CAATGGA,擴增溫度53.1 ℃)。用Trizol一步法提取腦組織總RNA,取總RNA 5 μL,在20 μL逆轉錄體系中合成cDNA,以5 μL cDNA為模板加入靶基因上下游引物,在50 μL體系中進行PCR擴增,檢測HMGB1、NF-кB(p-p65)含量的變化。

1.2.7檢測HMGB1、MMP-9、NF-кB(p-p50,p-p65)含量 在感染第7天時處死動物,大鼠腦組織100 mg左右,剪碎、放入勻漿器中,分別加入核蛋白裂解液提取蛋白。以BSA為標準,用Bradford法對上清進行蛋白定量后電泳、轉膜、曝光分析結果,檢測HMGB1、MMP-9、NF-кB(p-p50,p-p65)含量的變化。

1.2.8PDTC阻斷NF-кB通路的體外干預實驗 將5×104個/孔小鼠海馬神經元(HT-22)接種于6孔板中培養至70%～80%融合,隨機分為NC組、BM組、PDTC阻斷+丹參酮ⅡA干預組(bacterial meningitis+inhibitor+tanshinone ⅡA,BM+IH+TS組)及BM+TS組,NC組不做處理,BM組以細胞與菌液1∶1的數量持續感染3 h構建BM模型。BM+IH+TS組與BM+TS組,前組首先以200 μmol/L的PDTC加入細胞的培養基內干預24 h以抑制神經元細胞內NF-кB信號通路的激活,再加入20 μmol/L的丹參酮ⅡA液處理24 h后,滴入同數量的A.baumannii懸液構建感染模型;TS組以20 μmol/L的丹參酮ⅡA液加入細胞的培養基內預處理細胞24 h后,再以同樣的方法構建感染模型,驗證丹參酮ⅡA可能通過抑制NF-кB通路發揮BM引發海馬損傷保護作用的體內實驗的結論。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠日常表現

BM模型建立后,觀察大鼠的日常表現為:NC組大鼠精神狀態與活動能力良好,毛皮光滑,飲水、飲食及尿量正常;BM組、BM+TS組及丹參酮ⅡA干預各組的大鼠活動能力和進食均受到了一定程度的影響,毛發枯槁,精神不振或萎靡、飲食減少或厭食,反應遲鈍及自主活動減少等,但TS組大鼠的精神狀況和進食均比BM組、BM+TS組組改善很多。

2.2 學習與記憶能力

定向航行:自建模第2天開始,BM、BM+TS組與丹參酮ⅡA干預三組老鼠到達平臺的時間均較NC組延長,且以BM與BM+TS組兩組增長更明顯,差異有統計學意義(P<0.05),經過為期3 d的訓練,各組大鼠的逃避潛伏期均不斷降低,說明各組大鼠對水迷宮的空間環境已形成一定的記憶能力,均能較順利完成水迷宮的空間學習任務。空間探索:與對照組比較,BM、BM+TS組與丹參酮ⅡA干預三組老鼠在目標象限的停留時間和穿越平臺次數均減少,且BM與BM+TS組兩組變化更明顯,差異有統計學意義(P<0.05),證實BM引發的炎性損傷發生在海馬區確實使動物的學習、記憶能力降低,輔以適量的丹參酮ⅡA溶液治療對損傷的神經有一定的修復作用。見表1。

表1 四組大鼠水迷宮實驗潛伏期的比較

2.3 海馬區神經元細胞

Nissl染色結果顯示,NC組大鼠海馬區椎體層神經元細胞分布均勻、整齊,尼氏小體數量多;BM組與BM+TS組兩組大鼠在感染A.baumannii后海馬區椎體層神經元細胞分布稀疏、排列紊亂,尼氏小體數量減少;丹參酮ⅡA干預后的BM大鼠海馬區椎體層神經元細胞分布更趨均勻、整齊,尼氏小體數量增多,這一現象隨著感染時間的延長而更為明顯,提示丹參酮ⅡA溶液干預可促進海馬區神經元細胞增生。見圖1。

注：黑色箭頭表示海馬區椎體層神經元細胞的排列。

2.4 IL-6、IL-10、TNF-β表達

ELISA檢測海馬組織上清液中IL-6、IL-10、TNF-β的表達在BM與BM+TS組兩組明顯較NC組升高,而TS組中的表達雖較NC組有所升高,但相對其余2組表達量明顯降低,差異有統計學意義(P<0.05),但BM與BM+TS組組間差異無統計學意義(P>0.05),提示丹參酮ⅡA干預后炎癥因子表達明顯減輕。見圖2。

注：(1) 與NC組比較,P<0.05;(2)與BM+TS組比較,P<0.05。

2.5 HMGBl、NF-кB(p-p65)的mRNA表達

TS組HMGBl、NF-кB(p-p65)mRNA的表達增強,其在BM與BM+TS組兩組中mRNA的表達增強更為明顯,3組的HMGBl、NF-кB(p-p65) mRNA表達量均高于NC組,差異有統計學意義(P<0.05),但BM與BM+TS組兩組間差異無統計學意義(P>0.05),提示丹參酮ⅡA干預后炎性反應明顯減輕。見圖3。

注：(1) 與NC組比較,P<0.05;(2)與BM+TS組比較,P<0.05。

2.6 HMGB1、MMP-9、NF-кB(p-p50,p-p65)蛋白表達

Western Blot結果顯示:與BM與BM+TS組兩組比較,TS組HMGB1、MMP-9、NF-кB(p-p50,p-p65)蛋白的表達強度降低,3組中蛋白表達的強度均高于NC組,差異有統計學意義(P<0.05);但BM與BM+TS組兩組間表達差異無統計學意義(P>0.05),提示丹參酮ⅡA干預后炎性反應明顯減輕。見圖4。

注：(1) 與NC組比較,P<0.05;(2)與BM+TS組比較,P<0.05。

2.7 蛋白HMGB1、MMP-9的表達

體外PDTC阻斷NF-кB通路后 Western Blot結果顯示:與BM組比較,發生BM時加入丹參酮ⅡA干預(即BM+TS組)后HMGB1、MMP-9蛋白的表達強度明顯降低;發生BM時加入PDTC抑制NF-кB通路激活后再加入丹參酮ⅡA干預(即BM+IH+TS組)組內HMGB1、MMP-9蛋白的表達明顯升高;3組中蛋白的表達強度均高于NC組,差異有統計學意義(P<0.05),提示BM+IH+TS組雖然加入了丹參酮ⅡA干預,但可能因為NF-кB通路的抑制致使其保護作用并不明顯,故BM與BM+IH+TS干預兩組間比較,差異無統計學意義(P>0.05),從而推測丹參酮ⅡA可能通過NF-кB通路發揮保護作用。見圖5。

注：(1) 與NC組比較,P<0.05;(2)與BM+TS組比較,P<0.05。

3 討論

BM是一種嚴重的中樞神經系統感染,細菌感染患者腦組織時,一方面通過氧化還原失衡產生氧自由基,另一方面通過釋放促炎因子放大炎性反應加劇患者腦損傷,因而探索適當的抗氧化劑對BM的靶向治療具有重大的意義[10]。A.baumannii廣泛分布于自然界,是醫院內一種重要的條件致病菌,其影響機體可能的機制有:其毒力因子脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)可進入機體與血液中的LPS結合蛋白(LPB)結合成LPS-LPB復合物,繼而與單核-巨噬細胞表面的CD14分子作用進一步形成LPS-LPB-CD14復合物,通過MD-2蛋白激活TLR4進一步影響脂質A的合成,進而通過細胞內腫瘤壞死因子相關受體(transmissive right angle film,TRAF)、白細胞介素受體相關激酶(interleukin receptor-associated kinase,IRAK)等下游分子向下傳導,最終活化NF-кB和MAPKs通路釋放大量促炎因子而加劇炎性反應[11];A.baumannii可產生?-內酰胺酶從而改變外膜的通透性躲避宿主細胞的免疫攻擊[12-13];A.baumannii還可侵入上皮細胞的線粒體和細胞核內部啟動細胞凋亡機制從而誘導細胞凋亡等[14-16]加劇機體損傷。近來多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥A.baumannii不斷增多,使得A.baumannii感染成為治療方面的棘手問題[9],盡管A.baumannii引起的腦膜炎相對少見,但它與BM在重癥監護病房特別是顱腦術后的患者引起的高死亡率(70%)相關[3],因此探索A.baumannii感染造成的BM有相應的研究價值。HMGBl是一種高度保守的非組蛋白,具有誘導炎癥反應的能力,是BM發病機制中的一種主要的炎性介質,有效地抑制BM病理過程中炎癥因子的產生和釋放,是BM治療的基礎和前提。同時,HMGB1是內毒素血癥和膿毒癥的晚期介質,也是臨床預測嚴重膿毒癥患者預后的重要因子[17]。其在進化中高度保守,釋放出來的HMGB1與細胞膜上的晚期糖基化終產物受體或Toll樣受體(toll like receptor 2,TLR2)、TLR4受體結合激活MAPK、細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)及NF-кB信號進一步促進炎性反應加劇機體的損傷[18]。Zhu等[19]研究證實敗血癥小鼠血漿中HMGB1表達明顯增加,但丹參酮ⅡA處理后大大降低了血漿中 HMGB1水平而表現出明顯的抗炎效果。丹參酮ⅡA是從丹參中分離出的最豐富的二萜醌,本實驗從體內、體外兩個層次探索發現:發生BM后加入丹參酮ⅡA干預,炎性介質HMGB1無論從蛋白或是基因水平表達均明顯降低,證實丹參酮ⅡA因降低了 HMGB1表達水平而表現出明顯的抗炎效果,有效的發揮了保護作用。

發生BM時,MMP9溶解細胞外基質、參與破壞血腦屏障等是造成組織損傷的重要機制。Kim等[20]研究證實BM模型腦脊液中MMP9的水平明顯升高,其表達量的高低與腦損傷呈正相關,且MMP9的產生與氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的產生相關。本研究發現,發生BM時加入丹參酮ⅡA干預后MMP9的表達明顯降低、ELISA檢測促炎因子的表達降低,這均提示丹參酮ⅡA發揮了腦保護作用。NF-кB作為一種信號轉導途徑的樞紐,在許多生理、病理過程中發揮重要作用。本研究結果顯示,BM發生后加入丹參酮ⅡA干預,除了HMGB1與MMP9蛋白與基因的表達降低外,NF-кB通路p50與p65兩個磷酸化位點蛋白的表達也明顯降低;抑制NF-кB通路后加入丹參酮ⅡA干預上述蛋白的表達變化并不明顯,提示丹參酮ⅡA可能通過抑制NF-кB通路發揮BM誘導的海馬損傷的保護作用。

綜上所述,A.baumannii誘發的BM在加入丹參酮ⅡA干預后,可能因為氧自由基、炎性因子等的釋放減少而至損傷減輕,但在抑制了NF-кB通路后丹參酮ⅡA的腦保護作用不明顯,提示丹參酮ⅡA可能通過抑制NF-кB通路發揮BM誘導的海馬損傷的保護作用。BM患者在常規治療基礎上加入丹參酮ⅡA輔助治療,可能減輕患者的炎癥及氧化應激反應,減輕神經損傷程度從而發揮積極的腦保護作用,具體作用機制與炎癥、氧化應激反應及丹參所致腦血流變化等均密切相關,丹參酮ⅡA值得在日后臨床實踐中推廣應用。但BM引發的是全腦損傷,本實驗僅限海馬區損傷的探討,探討范圍有限且僅檢測了NF-кB通路的p65和p50兩位點磷酸化蛋白表達的變化,檢測方式較單一,課題組將會在后續實驗進程中上升到基因水平干預,從而得出更精確的結論,為臨床進一步探討BM提供確切依據。