NUDT15 rs116855232基因多態(tài)性與6-巰基嘌呤致ALL患兒淋巴細胞降低的相關性*

張濤濤,金皎,楊小燕,馬健娟,楊燦,李闖,2,楊玉婷,2,黃璟***

(1.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 兒科血液專科,貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫(yī)科大學 臨床醫(yī)學院,貴州 貴陽 550004)

急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia,ALL)是一組來源于血液、骨髓及髓外淋巴組織中淋巴前體細胞的惡性腫瘤,是兒童最常見的腫瘤,約占15歲以下兒童癌癥病例的25%[1-2]。ALL治療上目前以多藥聯(lián)合化療為主,巰嘌呤是其中重要的化療藥物之一。國內外研究顯示,巰嘌呤有白細胞(white blood cell,WBC)和/或中性粒細胞(neutrophile granulocyte,ANC)嚴重減低或缺乏、骨髓抑制、嚴重感染、肝毒性及食欲不振、惡心、嘔吐等不良反應,嚴重時會導致治療被迫中斷,從而對ALL患兒的長期緩解產(chǎn)生不利影響[3-8]。既往研究表明,巰嘌呤甲基轉移酶(thiopurines-methyltransferase,TPMT)和核苷酸焦磷酸酶15(nucleoside diphosphate-linked moiety X-type motif 15,NUDT15)的不同基因突變類型可影響6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)代謝,進而導致不同程度的骨髓抑制[9-10]。目前對6-MP所致的不良反應研究報道在WBC和/或ANC減少或缺乏及肝功能損害方面較多[3-7],對淋巴細胞的研究較少。因此,本研究在接受中國兒童腫瘤專業(yè)委員會ALL協(xié)作組2015方案(Chinese Children's Cancer Group Acute Lymphoblastic Leukemia-2015,CCCG-ALL2015)或CCCG-ALL2020治療的ALL患兒中進行研究,分析不同NUDT15基因型患兒在環(huán)磷酰胺+阿糖胞苷+6-MP(cyclophosphamide+cytarabine+6-mercaptopurine,CAT)階段化療期間與淋巴細胞降低的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2018年1月—2021年12月接受CCCG-ALL-2015或CCCG-ALL2020方案并完成CAT階段化療的ALL患兒,要求符合:(1)《血液病診斷及療效標準》(第3版)中ALL的診斷標準;(2)年齡≤14歲;(3)完善NUDT15基因檢測;(4)患兒及家長知情同意,≥8歲患兒同時簽署患者版及家長版知情同意書,<8歲其監(jiān)護人同意并簽署家長版知情同意書。排除標準:(1)成熟B-ALL、混合型白血病(不包括ALL伴有髓系抗原表達);(2)為第二腫瘤者;(3)繼發(fā)于免疫缺陷病者;(4)慢性髓細胞白血病急淋變者。共納入71例ALL患兒作為研究對象,其中25例采用CCCG-ALL2015方案化療,46例采用CCCG-ALL2020方案化療,年齡0.5～13歲、中位數(shù)5歲,男性43例(60.56%)、女性28例(39.44%),漢族31例(43.66%)、少數(shù)民族40例(56.34%),T型ALL 4例(5.63%)、B型ALL 67例(94.37%)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會審核批準(2021009K)。

1.2 研究方法

1.2.1收集一般臨床資料 收集患者住院期間的年齡、性別、診斷、危險度分層等臨床資料。

1.2.2常規(guī)血生化指標檢測 采集ALL患兒CAT階段化療前及化療期間清晨空腹外周靜脈血2～3 mL,采用BC-5380全自動血細胞分析儀(中國邁瑞)及其配合試劑對血樣標本進行檢測,并對WBC、ANC、淋巴細胞、血紅蛋白及血小板等血指標進行計數(shù),采用Cytomics FC500流式細胞儀對血液標本中的淋巴細胞各亞群、白血病免疫分型及白血病微小殘留病灶等進行檢測,并計算各血指標的下降速率[11]。

1.2.3磁珠法檢測基因組DNA 抽取ALL患兒CAT階段化療前及化療期間清晨空腹外周靜脈血2 mL,取血液標本200 μL置于離心管中,加Proteinase K溶液20 μL、裂解液GHL 300 μL,振蕩混勻;置于65 ℃孵育15 min,顛倒混勻3次,室溫放置5 min;加異丙醇350 μL,振蕩混勻30 s;(2)加磁珠懸浮液G 20 μL,振蕩混勻1 min,靜置3 min,每靜置3 min振蕩混勻1 min,共靜置9 min,置于磁力架上靜置30 s,待磁珠完全吸附后,小心吸去液體;(3)加緩沖液GDA 700 μL,振蕩混勻5 min,置于磁力架上靜置30 s,待磁珠完全吸附后,小心吸去液體;(4)加漂洗液PWD 700 μL,振蕩混勻2 min,置于磁力架上靜置30 s,待磁珠完全吸附后,吸去液體,重復該步驟1次;(5)室溫晾干10～15 min,加洗脫緩沖液TB 50～100 μL,振蕩混勻,置于56 ℃,孵育10 min,混勻3次,將一個切片切割至10 μm厚;(6)靜置2 min,磁珠完全吸附后,將DNA溶液轉移至1個新離心管中,-20 ℃保存。使用天根磁珠法血液基因組DNA 提取試劑盒和核酸提取儀[MagCore HF48,芮寶生物醫(yī)藥科技(廈門)有限公司]進行DNA提取(DNA溶液保存于-20 ℃條件下)。提取DNA樣品1～2 μL,使用 QubitTMdsDNA HS Assay Kit檢測濃度,使用Nanodrop one測定DNA的純度,經(jīng)DNA文庫構建獲得目標序列,使用核酸測序儀(ABI-3730XL,北京北嘉美儀生物科技有限公司)進行NUDT15基因檢測。根據(jù)NUDT15 rs116855232 基因型分為野生(CC)型和變異[雜合突變(CT)+純合突變(TT)]型。

1.2.4觀察不良反應及評價 參考世界衛(wèi)生組織抗癌藥物常見毒副反應分級標準[12-13],在CAT化療前及化療期間中將WBC、ANC、血紅蛋白及血小板發(fā)生最低值時進行不良反應分級,共分為5級,0 級為未出現(xiàn)不良反應,Ⅰ～Ⅱ級為輕度不良反應,Ⅲ～Ⅳ級為重度/嚴重不良反應。因目前沒有淋巴細胞分級相關文獻報道,故未將淋巴細胞減少納入不良反應分級。血細胞數(shù)最低值即CAT階段化療期間血細胞計數(shù)將至最低時的數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計學分析

雙人核對錄入數(shù)據(jù),采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,計量資料不符合正態(tài)分布采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)[M(P25,P75)]描述;計數(shù)資料以例數(shù)、構成比或率(%)表示,組間比較計數(shù)資料采用卡方檢驗,計量資料采用秩和檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NUDT15基因型

71例ALL患兒中NUDT15 rs116855232基因型有CC、CT及TT三種,分別有52例、17例及2例;C等位基因頻率為85.2%(121/142),T等位基因頻率為14.8%(21/142)。

2.2 不良反應

71例ALL患兒WBC、ANC、血紅蛋白均發(fā)生了不良反應,其中ANC發(fā)生嚴重不良反應的比例最高(表1),淋巴細胞減少41例(64.8%)。

表1 ALL 患兒發(fā)生血液相關毒副反應情況[n(%)]

2.3 不同NUDT15 rs116855232基因型患兒的不良反應

71例ALL患兒發(fā)生血液毒副反應分級情況比較結果見表2,NUDT15 rs116855232不同基因型患兒的WBC減少、ANC減少、血紅蛋白減少、血小板減少不良反應分級比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 不同NUDT15 rs116855232基因型ALL患兒的不良反應[n(%)]

2.4 不同NUDT15 rs116855232基因型患兒的血細胞下降幅度

不同NUDT15 rs116855232基因型患兒血細胞數(shù)值下降幅度結果顯示(表3),CC型與CT+TT型組患兒淋巴細胞下降幅度比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表3 不同NUDT15 rs116855232基因型患兒發(fā)生血液毒副反應時血細胞數(shù)值下降幅度[M(P25,P75)]

2.5 不同 NUDT15 rs116855232基因型患兒的血細胞下降速率

ALL患兒血細胞數(shù)值下降速率比較結果顯示(表4),CC型與CT+TT型組患兒淋巴細胞下降速率比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表4 不同 NUDT15 rs116855232基因型ALL患兒發(fā)生血液毒副反應時的血細胞數(shù)值下降速率[M(P25,P75)]

2.6 不同NUDT15 rs116855232基因型患兒的血細胞數(shù)最低值

ALL患兒血細胞計數(shù)最低時,CC型與CT+TT型患兒在WBC、ANC、淋巴細胞、血紅蛋白、血小板最低值比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表5)。

表5 不同NUDT15 rs116855232基因型ALL患兒發(fā)生血液毒副反應時的血細胞最低值[M(P25,P75)]

3 討論

兒童白血病是血液系統(tǒng)的侵襲性腫瘤,在我國15歲以下兒童死亡原因中居于第2位,白血病的各種類型中以ALL比例最高,是兒童中發(fā)病率最高的惡性腫瘤,約占所有兒童癌癥的1/3[14-15]。隨著兒童ALL化療方案的改進,ALL患兒的5年無事件生存率已高達90%[16]。目前兒童ALL治療手段主要有化療、造血干細胞移植、靶向免疫治療及嵌合抗原受體T細胞免疫療法(chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy,CAR-T)等,其中化療為一線療法[17]。6-MP是ALL患兒化療重要的化療藥物之一,貫穿兒童ALL治療的始終。

近年研究表明,亞洲人群中 NUDT15基因突變會導致其酶活性降低,是影響巰嘌呤藥物耐受性的關鍵因素[18-19]。有全基因組關聯(lián)研究報道,NUDT15的一個基因位點突變,它編碼一種新的硫嘌呤代謝酶,與6-MP誘導的WBC減少密切相關,特別是在亞洲人群中[3,20]。NUDT15是一種核苷二磷酸酶,其催化細胞毒性6-硫鳥嘌呤三磷酸(6-thioguanine triphosphate,6-TGTP)代謝物為毒性較小的6-硫鳥嘌呤單磷酸(6-thioguanine monophosphate,6-TGMP)。NUDT15介導的6-TGTP降解缺陷導致其過多的摻入DNA,從而導致DNA損傷和細胞凋亡[8,21]。Yang等[10]研究結果顯示,炎癥性腸病患者中NUDT15 rs116855232(p.Arg139Cys)與巰嘌呤誘導的WBC減少相關,NUDT15風險等位基因編碼p.Arg139Cys變異體在亞洲人群個體中更為常見,韓國、日本、中國及美國人等位基因頻率分別10%、7%、13%及2%。本研究NUDT15風險等位基因頻率為14.8%,與其他文獻結果基本一致。NUDT 15基因分布具有種族特異性,目前NUDT15基因突變位點主要有4種,在各個種族間的突變頻率差異較大,東亞人群NUDT15突變頻率位點最高的是c.415 C>T[22]。

孫廣毅等[23]研究認為,外周血淋巴細胞計數(shù)(peripheral lymphocyte counts,PLC)可以作為一項反映機體免疫功能的指標。淋巴細胞主要參與人體免疫調節(jié),有研究表明,腫瘤和機體間的炎癥和免疫應答在腫瘤的發(fā)展及預后中具有重要作用[24-25];淋巴細胞在免疫監(jiān)視中能抑制腫瘤的進展和轉移,其細胞毒性以及誘導細胞凋亡的能力可以控制腫瘤的生長[26-27]。本研究結果表明,ALL患兒在CAT方案化療期間,NUDT15 rs116855232 CC型與(CT+TT)型患兒的淋巴細胞下降有差異,這可能與ALL患兒使用化療藥物6-MP后導致機體免疫功能改變或缺陷有關,也可能是腫瘤自身與機體間的免疫反應所致。目前外周血淋巴細胞計數(shù)在使用6-MP化療的病例中研究報道較少,具體發(fā)生原因及機制尚不清楚,還有待未來進一步研究。

多數(shù)研究表明,接受6-MP常規(guī)劑量治療的ALL患者中,NUDT15 rs116855232(CT+TT)型發(fā)生WBC減少的程度較CC型患兒更嚴重[28-30]。本研究結果顯示,CC型與CT+TT型患兒發(fā)生WBC減少、ANC減少、血小板及血紅蛋白減少無相關性。這與既往研究結論不一致,可能與在CAT化療中,除6-MP外,還有阿糖胞苷、環(huán)磷酰胺等化療藥物聯(lián)合治療有關,多種化療藥物聯(lián)合使用可能會增加骨髓抑制的嚴重程度。也可能與研究的化療階段不同有關,國內外文獻主要研究的是維持治療階段NUDT15基因多態(tài)性與WBC和或ANC減少的相關性,本研究以CAT化療階段為方向,分別對WBC、ANC、淋巴細胞等血細胞減少情況進行分析,此階段是ALL化療方案中首次采用6-MP治療的階段,由于是第一次使用該藥,多數(shù)患兒機體對該藥反應較大,表現(xiàn)出不同程度的骨髓抑制,從而掩蓋了NUDT15基因多態(tài)性與6-MP所致不良反應的相關性。此外,在進入CAT階段時,部分患兒還處于上一個化療階段所致的骨髓抑制期,這也可能是導致本研究中心所得結論與其他研究結論不同的原因之一。同時本研究樣本量較小,且為單中心研究,這有待后期擴大樣本量后進一步研究。