miR-125b-5p對骨質疏松癥大鼠骨丟失的影響及其分子機制*

王槐駿,楊城,李瑋民,冉棟成,彭維艷,王春慶

(1.貴州醫科大學 臨床醫學院,貴州 貴陽 550004; 2.貴州醫科大學附屬醫院 急診外科,貴州 貴陽 550004)

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種臨床表現為骨強度下降的代謝性骨骼疾病,其特征是骨量減少和骨組織微觀結構破壞[1]。目前治療OP的藥物主要包括雙磷酸類藥物、骨合成代謝藥物、雷洛昔芬及雌激素等,但并不能治愈OP[2]。因此尋找新的治療方法或者靶點對于抑制OP的發生發展具有重要的意義。微小RNA(microRNA,miRNA或miR)是一類長度約為20～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA,是重要的轉錄后調控因子,常異常表達在許多疾病發生的過程中[3]。miRNA通過結合靶基因的3′-非翻譯區(untranslated region,3′-UTR)來干擾mRNA表達,從而改變生物活性[4]。miRNA通過相關信號通路調節靶基因的表達最終影響骨的生成及代謝[5]。因此有理由認為miRNA在OP的發病進程中起著重要的作用。目前已有研究報道,miR-125b-5p在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的骨丟失小鼠模型中顯著升高[6];此外,OP患者外周血和骨組織中miR-125b表達均異常升高[7],且miR-125b能夠抑制人牙周膜干細胞的成骨分化[8],因此有理由認為miR-125b-5p可能參與了OP的發病進程。然而,miR-125b-5p對OP大鼠骨丟失的調控作用及相關分子機制目前尚不十分清楚。因此,本研究擬探討miR-125b-5p對OP大鼠骨丟失的影響,同時利用生物信息學方法探討其潛在的分子機制,為闡明OP的分子機制提供實驗基礎及理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 6月齡健康清潔級Sprague-Dawley (SD)雌性大鼠15只,體質量(300±100)g,購自于學校動物房(430726210100391485);本研究已獲得學校實驗動物倫理審查委員會批準(1702032)。

1.1.2主要試劑與儀器 miR-125b-5p激動劑 (miR-125b-5p agomir,agomiR-125b-5p)、空載體陰性對照(NC agomir,agomiR-NC;上海吉瑪基因公司),磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution,PBS)緩沖液及1 mL注射器(中國biosharp公司);顯微計算機斷層掃描(microscopic computed tomography,micro-CT;德國Siemens 公司)。

1.2 研究方法

1.2.1基因芯片信息 從公共基因表達數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)[9]獲取OP相關數據集(GSE93883),其中包括3例健康人群的血漿樣本(GSM2464442、GSM2464443及GSM2464445),3例OP患者的血漿樣本(GSM2464453、GSM2464446及GSM2464451)。使用GEO2R工具在線分析篩選差異基因,將基因芯片表達矩陣信息下載分析miR-125b-5p的表達量,利用R軟件進行火山圖及熱圖可視化,標注miR-125b-5p;參數默認;差異閾值為fold change>2和P<0.05。

1.2.2OP模型大鼠的構建 選取3只大鼠,予5%異戊巴比妥鈉按5 mg/100 g行腹腔注射麻醉,脊柱兩側背部肋骨下緣開1～2 cm切口,剪下卵巢及部分輸卵管,予青霉素20 000 U/只腹腔注射預防感染3 d,為OP組;另選取大鼠3只,只行背部切口,不切除卵巢,為假手術(sham operation,Sham)組。術后3月,對上述2組大鼠采用micro-CT以12～20 μm的分辨率掃描骨骼,使用Bruker mCT評估軟件構建和分析骨骼的3D圖像,以骨體積分數(percent bone volume,BV/TV)、骨密度bone mineral density,BMD)評價OP模型構建是否成功[10]。

1.2.3OP大鼠分組及給藥 選擇6月齡雌性SD大鼠9只,按“1.2.2”項下方法構建OP模型大鼠,隨機均分為agomiR-NC組(agomiR-NC干粉33 μg+PBS溶液125 μL)、PBS組(PBS溶液125 μL)及agomiR-125b-5b組(agomiR-125b-5p干粉33 μg+PBS溶液125 μL),各組大鼠尾靜脈注射相應處理,1次/周,持續2個月;干預結束后脫頸椎處死各組大鼠,收集脛骨進行micro-CT掃描,記錄BV/TV、BMD、骨小梁數目(trabecular number,Tb.N)、骨小梁分離度 (trabecular separation,Tb.Sp)及結構模式指數(structure model index,SMI)等骨相關參數。

1.2.4hsa-miR-125b-5p-mRNA靶基因預測 公共數據庫 starbase(https://starbase.sysu.edu.cn/)作為微小rna-125b-5p (hsa-miR-125b-5p)靶基因預測來源,選擇以5種預測軟件中至少在4種預測軟件(targetScanSites[11]、picTarSites、RNA22Sites、PITASites、miRandaSites[12])中都預測到的信使RNA(messenger RNA,mRNA)作為最終結果,再使用cytoscape軟件[13]對miR-125b-5p-靶基因調控網絡進行可視化。

1.2.5基因本體( gene ontology,GO)功能富集分析、京都基因和基因基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信號通路分析 使用clusterProfiler R包(v3.18.1)[14]對在“1.2.4”項下至少4種預測軟件都預測到的靶基因進行GO富集和KEGG分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-125b-5p的表達

通過GEO2R在線分析共獲得956個差異miRNA,其中502個上調,454個下調;利用 R 包繪制火山圖及熱圖進行可視化分析發現,OP患者血漿中miR-125b-5p顯著增高。見圖1。

注：A為通過GEO2R在線分析篩選出的差異基因繪制的火山圖,紅點表示上調的miRNAs,綠點表示下調的miRNAs,灰點表示無顯著意義變化的miRNAs;B為利用基因芯片表達矩陣信息繪制的熱圖,紅色表示差異miRNAs上調,藍色代表差異miRNAs下調。

2.2 OP模型大鼠的構建

去卵巢術后3個月對OP組及Sham組大鼠脛骨行micro-CT掃描提示,相較于Sham組,OP組大鼠脛骨骨量明顯減少,且BV/TV、BMD低于Sham組(P<0.05或P<0.01),提示本研究OP模型構建成功。見圖2。

注：A為micro-CT掃描松質骨三維成像圖(2.3×),B、C分別為BV/TV和BMD的定量結果;與Sham組比較,(1)P<0.01,(2)P<0.05。

2.3 agomiR-125b-5p對OP大鼠骨量的影響

去卵巢術后連續注射2月對3組大鼠脛骨行micro-CT掃描,結果提示(圖3),與agomiR-NC組與PBS組比較,agomiR-125b-5p組大鼠骨小梁稀疏,骨量減少;與agomiR-NC組比較,agomiR-125b-5p組大鼠脛骨BV/TV和Tb.N下降,Tb.Sp和SMI升高,差異均有統計學意義(P<0.05);agomiR-NC組與PBS組大鼠脛骨上述指標比較,差異無統計學意義(P>0.05)。

注：A為micro-CT掃描二維成像圖(2.3×);B為BV/TV、Tb.N、Tb.Sp及SMI骨參數指標定量結果;(1)與agomiR-NC組比較,P<0.05。

2.4 hsa-miR-125b-5p的靶基因

預測結果顯示,4 種軟件預測hsa-miR-125b-5p的靶基因102個,進行網絡進行可視化(圖4);5 種軟件都預測到hsa-miR-125b-5p 的靶基因8個,分別是BCL2拮抗劑/殺傷因子1(BCL2 antagonist/killer 1,BAK1)、磷酸核糖焦磷酸酰胺轉移酶(phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase,PPAT)、亮氨酰和胱氨酰氨肽酶(leucyl and cystinyl aminopeptidase,LNPEP)、SUV39H1組蛋白賴氨酸甲基轉移酶(SUV39H1 histone lysine methyltransferase,SUV39H1)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖4 (glypican 4,GPC4)、絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶11 (mitogen-activated protein kinase kinase kinase 11,MAP3K11)、高爾基體相關ARF結合蛋白2 (golgi associated,gamma adaptin ear containing,ARF binding protein 2,GGA2)及氧甾醇結合蛋白樣9 (oxysterol binding protein like 9,OSBPL9)。

注：紅色為hsa-miR-125b-5p,藍色則為hsa-miR-125b-5p下游預測到的mRNA。

2.5 GO功能富集分析和KEGG信號通路分析

對“2.4”項下預測到的102個靶基因進行GO富集分析,根據富集數目及顯著程度,選取10條GO功能過程繪制氣泡圖,結果顯示,GO富集涉及生物過程(biological process,BP)主要包括pre-microrna的處理、負調控冷誘導產熱和調節細胞生長的程度等,分子功能(molecular function,MF)顯示主要為金屬胺肽酶活性、泛素結合酶活性等;對預測到的102個靶基因進行KEGG分析,選取前10條通路,結果顯示KEGG信號通路為腎素-血管緊張素系統和泛素介導的蛋白質水解等。見圖5及表1。

表1 預測的miR-125b-5p下游靶基因的KEGG信號通路

注：A、B及C分別為BP、MF及KEGG信號通路;顏色越紅代表P值越小、可信度越高,圓點越大、表示數目越多。

3 討論

前期研究發現OP患者miR-125b-5p異常升高[15],因此有理由認為miR-125b-5p可能參與OP的發生發展。為了研究miR-125b-5p在OP進程中的作用,首先利用生物信息學技術分析表明,miR-125b-5p在OP患者血漿中顯著升高,這個結果進一步表明了miR-125b-5p在OP中的重要性。因此,為研究miR-125b-5p在OP中的作用,本課題組將miR-125b-5p的模擬物注射到雙側卵巢切除后的大鼠尾靜脈,用以評估其作用。雙側卵巢切除術的雌性大鼠目前已經成為最常用的OP模型,可模擬絕經后由于雌激素缺乏所誘導的骨丟失[16]。通過大鼠尾靜脈注射后收集各組大鼠脛骨進行micro CT掃描檢測的結果表明,相較于其他組,agomiR-125b-5p 組大鼠脛骨BV/TV和Tb.N下降,Tb.Sp和SMI升高。BV/TV、Tb.N、Tb.Sp及SMI均是骨結構參數,可用于精準檢測松質骨的定量分析[17]。上述結果表明了agomiR-125b-5p可以顯著促進去卵巢后大鼠由于雌激素缺乏所誘導的骨丟失。

上述結果表明agomiR-125b-5p可以促進OP大鼠的骨丟失,但是其調控骨丟失下游的靶基因及通路尚未明確,因此本研究通過生物信息學對其進行分析。首先對miR-125b-5p進行靶基因預測,由于不同預測軟件預測有一定差異,因此取5種預測軟件所獲得的靶基因交集進行探討更具有可信度;分析后取交集共獲得了靶基因8個,分別是PPAT、LNPEP、SUV39H1、GPC4、BAK1、MAP3K11、GGA2及OSBPL9,提示這些預測到的靶基因可能與miR-125b-5p促進骨丟失密切相關。有研究報道,缺乏 BAK會減少成骨細胞和骨細胞的凋亡并增加骨量[18]。miR-125b-5p可能是通過減少BAK1的表達,進而減少成骨細胞的凋亡,最終增加骨量,因此BAK1可能是參與OP的發病的重要靶基因。而其他預測到的靶基因關于OP的研究尚不清楚,因此這些靶基因可作為調控OP發展下游的分子進行研究,為闡明OP的分子機制研究提供實驗依據。

GO與KEGG富集分析有助于更深入地認識并識別出miR-125b-5p靶基因的功能和機制。對4種軟件預測到的102個靶基因進行GO富集和KEGG分析,結果顯示miR-125b-5p靶向基因的BP主要在pre-microrna的處理、負調控冷誘導產熱及調節細胞生長的程度等;pre-microRNAs(pre-miRNAs)是60～120個核苷酸(nt)的莖環結構,能夠被核糖核酸酶(ribonuclease,RNase)Ⅲ酶Dicer切割成短的約21 nt的雙鏈(ds)RNAs,該雙鏈RNAs可與microRNA效應子Argonaute(Ago)結合,結合后去除1條RNA鏈,再由Ago-miRNA復合體通過翻譯抑制和mRNA降解抑制目標基因的翻譯[19]。在冷誘導的棕色脂肪組織(brown adipose tissue,BAT)非戰栗產熱(non-shivering thermogenesis,NST)會激活相關的代謝效應,包括增加能量消耗、胰島素敏感性、脂肪分解和脂肪酸氧化,最終有助于控制肥胖和代謝性疾病存在的能量失衡和病理生理后果[20]。以上結果揭示,miR-125b-5p的靶基因可能主要是通過Ago-miRNA復合體抑制目標基因的翻譯、調節冷誘導產熱的相關代謝效應以及相關成骨細胞與破骨細胞的生長最終促進OP大鼠的骨量丟失。

在GO富集MF中,金屬氨基肽酶活性位居前列,該酶存在于所有類型的生物體中,可利用外源性蛋白質作為營養物質和消除非功能性蛋白質,在胚胎發生、免疫反應、血管生成、腫瘤細胞侵襲和轉移等生理及病理過程中發揮關鍵作用[21]。泛素結合酶系統與幾種退行性疾病有關,在C-X-C基序趨化因子配體6(C-X-C motif chemokine ligand 6,CXCL7)缺陷小鼠中進行了磷酸化蛋白質組學分析,結果顯示泛素蛋白連接酶 E3C (ubiquitin protein ligase E3C,UBE3C)磷酸化增加,CXCL7與后縱韌帶骨化密切相關[22]。這些表明miR-125b-5p的靶基因促進OP大鼠骨丟失在分子功能上可能是通過調控金屬氨基肽酶活性及泛素結合酶等來進行的。

KEGG富集分析結果顯示,腎素-血管緊張素系統(renin-angiotensin system,RAS)在miR-125b-5p靶基因的KEGG分析中占主要作用。有研究表明,RAS在骨組織中局部存在,并且在成骨細胞和破骨細胞上表達,還可通過血管緊張素Ⅱ (angiotensinⅡ)受體發揮作用,對炎癥性骨病起到重要作用[23]。有研究表明,RAS 的激活誘導高周轉OP并加速骨吸收[24]。Li等[25]研究發現,泛素特異性蛋白酶(ubiquitin-specific protease,USPs)通過促進骨形成或拮抗骨吸收參與調節骨代謝,泛素特異性肽酶26(ubiquitin specific peptidase 26,USP26)通過降低293T細胞中泛素化進而對骨代謝進行調控。Yang等[26]發現泛素化和降解在保持破骨細胞的活性及骨吸收方面起著重要作用。以上結果表明,腎素-血管緊張素系統信號轉導通路和泛素介導的蛋白質水解信號轉導通路在調控骨代謝中起著重要作用,提示這些相關通路與miR-125b-5p調控OP大鼠骨量丟失的潛在機制密切相關,可作為后續的研究提供思路。

綜上所述,miR-125b-5p能夠促進OP大鼠的骨丟失,其潛在的機制可能是通過BAK1等相關mRNA相互作用,涉及腎素-血管緊張素系統信號轉導通路和泛素介導的蛋白質水解信號轉導通路等多種途徑從而為下一步研究OP的分子機制提供了實驗基礎及理論依據。