神經系統及其分泌物在運動改善骨健康中的作用機制

劉波 陳祥和 楊康

1.江蘇旅游職業學院體育部,江蘇 揚州 225127 2.揚州大學體育學院,江蘇 揚州 225127 3.蘇北人民醫院康復醫學科,江蘇 揚州 225127

骨穩態包括成骨細胞(osteoblast,OB)介導的骨形成與破骨細胞(osteoclast,OC)介導的骨吸收,OB及OC功能失調、骨髓間充質干細胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)分化異常均會影響骨穩態。運動刺激會觸發多種生理機制,從而促進BMSCs的成骨分化并激活OB,因此,運動引起的機械應力對骨細胞是一種異常強大的刺激[1]。骨重塑是骨穩態的重要過程,受神經系統調節,因此神經系統的功能穩定對骨健康有重要意義。神經系統由中樞神經系統(central nervous system,CNS)和周圍神經系統(peripheral nervous system,PNS)組成,兩者可通過其分泌的神經遞質及廣泛的外周神經突觸來實現對骨代謝的調控[2]。目前,運動訓練通過改變神經活動進而影響骨健康的相關機制仍不清晰,本研究通過探究神經與骨骼之間的串擾及其對骨功能和新陳代謝的影響,總結運動通過影響神經系統進而調節骨穩態的機制,為運動促進骨健康提供新的視角和理論建議。

1 中樞神經及其分泌物與骨健康

神經肽Y(Neuropeptide Y,NPY)是一種多功能神經肽,存在于CNS及骨組織中,參與多種生理病理過程如骨代謝相關疾病[3]。NPY是高度保守的內源性肽和多功能神經遞質,在CNS中主要分布于杏仁核、腔腸位點及大腦皮層中,并高表達于下丘腦[3]。目前,參與骨重建的主要包括Y1R和Y2R[4-6]。

Y1R參與眾多生理活動[7]。骨質疏松患者骨中NPY和Y1R表達上調,通過對去卵巢小鼠注射Y1R拮抗劑后發現,其骨密度(bone mineral density,BMD)、BV/TV、Tb.Th、Tb.N和 血清Ca2+顯著上升[8],進一步研究發現,抑制NPY可通過上調Runt相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2,Runx2)、成骨細胞特異基因(Osterix)表達促進MC3T3-E1細胞成骨[9]。在骨組織中,Y1R高表達于BMSCs、OB、骨細胞、單核細胞/巨噬細胞以及OC,以發揮其局部調節作用。一方面,Y1R基因缺失會下調酸性磷酸酶TRAcP5b和MMP-9、組織蛋白酶K(Countersink,CTSK)等物質表達,損害OC骨吸收功能[10],減弱骨吸收作用;另一方面,Y1R基因缺失能提高OB活性及礦物質沉積速率,增加骨形成,使脛骨直徑增加[11]。并且從Y1R基因敲除小鼠中分離的BMSCs顯示出明顯的增殖和礦化[12],該現象與Y1R抑制環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosph,cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase,PKA)/cAMP反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)信號通路活性,進而影響下游調控BMSCs成骨轉錄的因子有關。BMSCs的成骨細胞譜系決定由眾多轉錄因子協同驅動[13]。在BMSCs成骨誘導的24 h中,Tead4、Smad3等轉錄因子表達顯著增加,而Tead1和Junb表達被Y1R顯著抑制,且PAK活性及CREB磷酸化也出現下降[14],從而抑制骨形成。通過用重組慢病毒在未分化的BMSCs中過表達Tead1和Junb后發現,Y1R的抗骨生成及促脂肪生成作用被抑制,骨形成提高[14]。進一步研究發現,骨中交感神經末梢和副交感神經末梢分別釋放的神經遞質(neurotransmitter,NE)和乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)可作用于各自受體β2AR和M3R,分別來刺激和抑制Y1R的生產,Y1R又可通過抑制cAMP/PKA/CREB信號轉導來抑制成骨/抗成脂轉錄因子Tead1和Junb表達,從而調節BMSCs由成骨轉向成脂[14]。而通過使用cAMP類似物db-cAMP處理可激活PKA/CREB信號傳導,逆轉成骨分化過程下BMSCs中Y1R誘導的Tead1和Junb表達降低,阻斷Y1R對BMSCs的抗骨生成和促脂肪作用[15]。綜上,Y1R通過抑制cAMP/PKA/CREB信號傳導來靶向Tead1和Junb表達,以將BMSCs分化命運從成骨轉向脂肪生成,而使用NPY-Y1R拮抗劑可以促進BMSCs的成骨細胞分化過程。另外,阻斷Y1R還可通過激活cAMP/PKA/CREB信號通路來提高核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)/骨保護素(osteoprotegerin,OPG)比值,從而改善骨骼微結構[16]。

另一種參與骨代謝的神經肽是Y2R。作為一種自身受體,Y2R主要位于突觸前,是CNS中最豐富的亞型[17]。Y2拮抗劑治療去卵巢小鼠可降低骨吸收水平及提高BMD,通過敲除下丘腦中Y2R可提高OB活性、礦化速率及骨量[18]。研究發現,無論是敲除Y2受體全部基因或特異性敲除下丘腦神經元Y2受體基因,均只對OB的活性增加及骨細胞礦化沉積率起作用,而對OC活性及骨吸收速率無明顯改變[19]。張妍等[20]研究發現,摘除大鼠雙側卵巢會導致BMD明顯降低,同時下丘腦使NPY和Y2受體基因表達顯著升高,經補腎化痰方干預后BMD明顯升高,NPY、Y2受體蛋白水平降低,表明Y2R在骨吸收中起重要作用。

食欲素是由下丘腦分泌的一種肽激素,以食欲素-A和食欲素-B的形式存在于小腸、肝臟及其他器官中,可加速小鼠MC3T3-E1細胞的成骨分化和基質礦化,食欲素基因敲除小鼠表現出低骨量[21]。慢性缺氧會導致氧化應激、交感神經活動加強以及發生炎癥反應,破壞OB和OC之間的動態平衡,引起骨丟失[22]。通過食欲素-A治療能通過激活OX1R-Nrf2/HIF-1α通路來刺激骨血管生成,減少氧化應激和細胞凋亡,促進成骨[23]。

綜上,中樞神經分泌物及神經-骨骼耦合在骨質健康中起重要作用[24]。

2 PNS及其分泌物與骨健康

2.1 感覺神經及其分泌物與骨健康

在PNS中,神經元存在于感覺神經節和自主神經節中,其具有內分泌功能并可影響骨形成[25]。四肢中的感覺神經元起源于脊髓旁邊的背根神經節(dorsal root ganglion,DRG),具有感知疼痛、機械壓力、熱環境及其他刺激,并將刺激傳遞給中央處理[26]。此外,這些神經元的側支軸突分支可以產生針對其周圍目標組織的傳出信號并分泌神經肽,而神經肽的這種局部釋放表明了感覺神經的營養性質及其調節骨骼活動的能力[27]。

感覺神經纖維可通過分泌肌鈣蛋白受體激酶A(tropomyosin receptor kinase A,TrkA)來調節骨重塑過程[28]。神經生長因子(nerve growth factor,NGF)能通過激活TrkA感覺神經元來傳遞損傷信號并修復神經元,并在胚胎發育期間調節TrkA神經元向長骨軟骨膜的生長。當TrkA信號和神經支配被抑制時,初級和次級骨化中心血管生成減少,導致Osterix骨祖細胞生成減少,從而減少了股骨的長度和體積[29]。腦信號蛋白3A(semaphoring 3A,Sema3A)也是一種軸突引導分子,對外周神經元的正常發育至關重要[30]。研究表明,神經元中Sema3A的特異性缺失會導致骨量降低,而OB特異性Sema3A缺陷小鼠骨量正常。進一步研究發現,神經元特異性Sema3A缺陷小鼠的小梁骨感覺神經支配數量顯著減少,導致骨異常[31],表明Sema3A可通過刺激感覺神經支配和再生從而促進骨再生。降鈣素基因相關肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)和SP來源于感覺神經,可刺激成骨分化和骨形成。CGRP能通過抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的活化促進骨祖細胞的增殖,減少其凋亡并增強成骨基因的表達和OB活性[32];也可通過激活絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路促進BMSCs的募集和細胞增殖,上調堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runx2的表達并促進成骨分化[33]。在骨損傷或骨折后,富含CGRP的纖維能觸發血管周圍骨再生,并且局部注射CGRP也可有效加速骨形成[34]。臨床研究發現,骨折患者血清CGRP濃度及骨折局部CGRP陽性纖維顯著增加,這能促進BMSCs及血管內皮細胞(vascular endothelial cell,VECs)增殖以及BMSCs成骨分化中的血管生成,最終提高骨形成[35]。SP表達于周圍神經,可通過結合并激活NK-1受體(NK-1R)來增加BMSCs增殖及成骨分化[30]。SP對OB的作用包括促進成骨和抑制凋亡兩種:如SP通過RANKL、MAPK及影響BMSCs成骨分化過程來促進成骨[36],或SP通過激活β-catenin和c-myc等基因和蛋白,進而激活經典Wnt通路來實現抑制凋亡的作用,從而保護神經[37]。Liu等[38]發現低濃度的SP可促進ALP和Runx2表達,而高濃度SP促進了基質礦化。進一步研究表明,SP可激活MAPK、Wnt、骨形態發生蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP)等信號通路及上調血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達,促進血管生成和成骨分化[39]。此結果表明感覺神經衍生物可影響骨穩態。

2.2 自主神經及其分泌物與骨健康

自主神經系統(autonomic nervous system,ANS)可分為交感神經系統(sympathetic nerve system,SNS)和副交感神經系統(parasympathetic nervous system,PSNS),與長骨中的大血管結構緊密接觸[40]。酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase,TH)是交感神經的免疫組織化學標志物;而副交感神經軸突所表達的囊泡乙酰膽堿轉運蛋白和膽堿乙酰轉移酶存在于長骨的骨髓空間中,通過追蹤TH、囊泡乙酰膽堿轉運蛋白和膽堿乙酰轉移酶可探究自主神經對骨重塑的作用[41]。ANS可抑制骨重塑,其中SNS激活會刺激骨吸收,而PSNS會抑制骨吸收,積累骨量[42]。在晝夜節律中,交感神經活動在白天活躍,此時是骨吸收高峰期,而副交感神經活動在夜間占主導地位,此時骨形成活躍[43]。OB和OC表達的多種腎上腺素能受體可響應交感神經末梢釋放的去甲腎上腺素而被激活,也可對副交感神經末梢釋放Ach作出反應[44]。表明ANS可通過釋放靠近骨細胞的神經遞質對骨骼產生影響。此外,中樞神經衍生物可通過ANS來調節骨健康。如由腦干神經元合成的血清素可與下丘腦腹內側核(ventromedial hypothalamus,VMH)神經元中的Htr2c受體結合,抑制SNS活動來促進骨量積累[45]。綜上所述,PNS可通過不同信號通路調節骨形成。

3 神經系統及其分泌物在運動改善骨健康中的作用機制(圖1)

圖1 神經系統分泌物在運動改善骨健康中的作用機制

運動不僅在骨代謝及神經系統中獨立發揮作用,還調節神經系統與骨代謝之間的相互作用過程。研究發現,機械負荷會刺激骨骼系統中的前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)水平,在骨質疏松條件下,每個骨重塑單位面積的相對機械負荷增加,導致OB分泌更多的PGE2來刺激感覺神經,進而調節骨形成[46]。Bonnet通過對去卵巢大鼠(ovariectomized,OVX)分別進行8周高強度跑臺運動、沙丁胺醇(salbutamol,SAB)及兩者聯合干預表明,與OVX+運動大鼠相比,SAB治療導致OVX+SAB+運動大鼠的骨體積、骨小梁厚度、礦物質沉積率、長骨極限力和剛度降低,這與SAB干預導致交感神經激活,使骨吸收過程加快進而抵消跑臺運動的促骨生成作用有關[47]。另一研究顯示,C57BL/6小鼠在經過8周有氧運動干預后,股骨遠端和脛骨近端的骨膜神經纖維密度分別提高了99%和88%,生長相關蛋白43(growth-associated protein-43,GAP-43)、β-肌動蛋白和神經蛋白的mRNA表達上升導致本體脊髓神經元的再生提高了70%,這與骨面骨密度、骨礦物質含量和骨小梁數增加吻合[48],提示運動造成的骨質改善與脊髓神經元的生長聯系緊密。

杏仁核介導肌骨系統的中樞機械感覺反饋,這主要由(basolateral amygdala,BLA)和中央內側核(central medial nucleus,CeM)傳導。通過將標志物AAV-CaMKII-hM3Dq-mCherry或AAV-CaMKII-mCherry雙側注射到C57小鼠的BLA區域,并注射A型肉毒桿菌毒素(botulinum toxin type A,BTxA)誘導后肢肌肉萎縮,然后用氯氮平N-氧化物(CNO)腹膜內治療4周,結果顯示,BTxA注射使得肌肉發生萎縮,同時降低了骨小梁數目及間距、皮質骨密度;而CNO治療后,BLA CaMKII神經元的化學遺傳操作改善了由肌肉萎縮誘導的嚴重骨丟失,骨小梁數量和BMD顯著增加[49],說明BLA神經元的激活可減輕肌肉萎縮引起的骨質流失。進一步研究發現,在注射BTxA誘導的肌肉萎縮中血清Sema3A、Sema24A水平顯著下降,同時感覺神經纖維密度顯著降低;經CNO治療后,BLA神經元被激活,血清中Sema29A、Sema3A顯著增加,骨中感覺神經支配密度增加,BMD提高[50]。提示提高肌肉力量和機械負荷能激活BLA神經元進而通過Sema3A調節的感覺神經支配調節骨穩態。與上述研究相似,周丹丹[51]對骨質疏松大鼠進行6周頻率為35 Hz、振動幅度為2 mm、加速度為0.5g的全身振動后發現,機械振動能提高骨組織中神經衍生物CGRP、SP、Sema3A的濃度,降低骨組織中FGF23的表達,從而增加OB活性及分化能力并降低其凋亡能力,減弱OC活性,使骨形成大于骨吸收,促進骨質疏松后骨折愈合。表明運動誘導的神經元再生進而改善骨健康與神經衍生物的分泌增多有關。

辣椒素干預新生小鼠會破壞無髓鞘和小直徑有髓鞘的感覺神經元,可用于研究周圍神經在機械負荷刺激影響骨代謝和骨骼適應中所發揮的作用[52]。在對成年大鼠使用辣椒素干預的研究中發現,60周的辣椒素治療可誘導骨小梁丟失、OC數量增加、OB活性降低及骨組織中SP和CGRP濃度降低4%～70%[53],這可能與周圍神經損傷導致神經衍生物分泌減少有關。在此基礎上,通過對辣椒素干預后的新生小鼠進行機械負荷刺激發現,其脛骨皮質骨面積增加,表明周圍神經的損傷并不影響運動刺激的骨形成作用,這可能與中樞神經衍生物對骨的調控作用有關[54]。

因此,運動訓練能促進神經營養因子和神經肽等營養物質的生成提高,這對于神經元的再生及穩態,以及影響骨健康有重要意義。

綜上所述,骨重塑受中樞和外周神經的支配,其分泌的神經肽及遞質參與骨骼發育,而運動能通過調節神經系統功能及其分泌物的產生,促進骨形成。如機械負荷可提高PGE2水平來刺激感覺神經再生,促進骨形成[46];8周有氧運動干預能提高GAP-43、β-肌動蛋白和神經蛋白的mRNA表達,促進骨膜神經纖維密度,促進骨形成[48];機械刺激能激活BLA神經元進而通過Sema3A調節的感覺神經支配調節骨穩態[50];6周機械振動能提高CGRP、SP、Sema3A的濃度,降低骨組織中FGF23的表達,增加OB活性及分化能力,促進骨質疏松后骨折愈合[51];跑臺運動能促進神經元軸突再生來增加骨神經支配比例,改善骨形成[47]。