不同來源外泌體與骨質疏松癥的研究進展

吳世祥 尹恒,馬勇 崔恒燕 武豪 李青融 韓保國 倪志明 張亞峰.2*

1.南京中醫藥大學,江蘇 南京 210023 2.南京中醫藥大學無錫附屬醫院,江蘇 無錫 214071

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種全身性的骨骼疾病,由多種因素導致患者的骨密度降低、骨質量變差甚至會導致骨組織微觀結構的退行性病變,進而引發了人體的骨脆性增加,更加容易致使患者發生骨折的代謝性骨病。目前骨密度(bone mineral density,BMD)是臨床上用來評估骨質疏松癥的最常用的測量方法。國內采用的雙能X線吸收法(DXA),DXA計算T值需采用中國人數據庫,T值≥-1.0 SD 為正常;-2.5 SD

眾所周知,當破骨細胞骨吸收大于成骨細胞骨形成,則會導致骨礦物質減少,直接會導致骨質疏松癥,因此,臨床上治療骨質疏松的策略目前主要是通過促進骨形成或者抑制破骨細胞活性。破骨細胞活化和分化的抑制劑已經在臨床上已使用多年,例如雌激素、雙膦酸鹽、降鈣素、地舒單抗等,但是這些藥無法促進骨細胞的形成、功能的恢復以及骨結構的重建,甚至還會產生相應的不良反應[4-5]。所以,迫切需要找到靶向骨再生同時將藥物治療引起的潛在危害最小化的治療方法,而外泌體則是作為治療骨質疏松的潛在骨靶向藥物[6]。

1 外泌體的概述

外泌體是(EXOs)由細胞內多泡體與細胞膜融合后釋放到細胞外基質中的膜性囊泡。幾乎所有類型的細胞,都可以產生并釋放外泌體。它是一種直徑為30～60 nm的納米級脂質雙分子包裹體結構,內部包裹了蛋白、脂質衍生物、mRNA和micoRNA等物質。外泌體通過體內器官循環系統到達其他細胞與組織,與靶細胞結合,進而產生生物間的作用,而目前大量的研究表明,來源不同的外泌體所產生的功能也不盡相同,而其中有些來源的外泌體的功能與骨代謝相關聯。其中,Qin等[7]指出,外泌體可以通過調控體內骨形成以及血管形成進而刺激骨細胞再生的分子機制作用。一方面,外泌體通過參與除細胞外介質的信息傳遞和交流而產生作用;另一方面,對于體內不同的骨細胞而言,外泌體在一定程度上具有修復及促進骨細胞再生的生理作用,并通過這條路徑來調控骨的生理和病理狀態[8-9],見圖1。

圖1 外泌體與骨形成的關系

2 不同來源的外泌體和骨質疏松癥的關聯

2.1 脂肪源性外泌體與骨質疏松癥關聯

脂肪源性干細胞(ADSCs)是間充質干細胞的一種,可以從多種來源的脂肪組織中輕易獲得,并且具有多分化以及自我更新的潛能[11]。目前研究發現ADSCs數量眾多,它們易于分離、可操作,具有增殖和分化潛力,并且它們的端粒酶活性比BMSCs受年齡的影響更小,可以應用于骨質疏松癥的骨再生[12-13]。因此,ADSCs應用的可能是骨質疏松癥中的骨形成和骨結構的重建一種基于BMSC有前景的治療策略[14]。來源于脂肪干細胞的外泌體(ADSCs-Exos)會含有ADSCs的活性物質,同時也會產生與ADSCs相關的生理功能。2001年,Zuk等[15]的研究從脂肪組織中分離出ADSCs,并且發現ADSCs可以經過培養分化成脂肪、成骨、成軟骨以及成肌細胞。作為ADSCs重要的生物活性物質,ADSCs-Exos在許多疾病中體現出了很強的再生潛力[16]。Wang等[17]研究顯示,TNF-a可以增加miR-141-5p的生成,進而抑制原代成骨細胞的增殖分化,而通過嘗試用ADSCs-Exos培養經過TNF-α處理過的原代成骨細胞,發現ADSCs-Exos可以促進細胞存活而減少細胞的凋亡,這表明ADSCs-Exos可以作為治療骨質疏松癥患者的有前途的潛在標志物。雖然目前國際上的研究發現ADSCs-Exos治療骨質疏松癥的臨床效應是有益的,但是其作用的潛在機制尚未明確,這需要我們在不久的將來通過更多的研究,以便于更加精確地描述這其中的潛在作用機制。

2.2 骨源性外泌體與骨質疏松癥的關聯

2.2.1骨髓間充質干細胞外泌體:骨髓間充質干細胞(BMSCs)在某種程度被認為是骨髓中成骨細胞和脂肪細胞的共同祖細胞,但是這兩種細胞本身是相互排斥的。人體在衰老的同時,機體會抑制成骨細胞的形成,同時會增加脂肪細胞的形成,進而導致骨質疏松癥的產生。由于外泌體的納米顆粒大小、具有的脂雙層結構和表面的特異性抗體,它們還可以發揮細胞通訊的作用并具有傳輸特性,使其成為治療骨質疏松疾病的藥物遞送系統的理想候選者[21]。骨髓間充質干細胞外泌體(BMSCs-Exos)是BMSCs的主要活性產物,它應該具備BMSCs的生理功能,可以促進成骨細胞的形成與分化,增加成骨細胞中骨基因的含量,促進骨的形成,這為BMSCs-Exos正向調節骨代謝提供一定的理論支撐[18]。研究表明,BMSCs-Exos可抑制脂肪生成分化,同時促進成骨分化和血管化,這逆轉了成骨和脂肪生成轉化之間的不平衡[19]。Wnt/β-Catenin通路是抑制成脂基因表達、恢復成骨細胞增殖和分化的重要信號機制。BMSCs-Exos攜帶microRNA-335,通過VapB和Wnt/β-連環蛋白途徑促進骨折恢復和成骨細胞分化[23]。

Zhao等[20]將BMSCs-Exos與成骨細胞共培養,發現與絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路相關的蛋白表達增加,細胞周期S期所占比例顯著增加,提示BMSCs-Exos可通過激活MAPK信號通路促進成骨細胞增殖。Zhang等[21]研究發現,BMSCs-Exos顯著增加股骨發育不良大鼠模型的成骨、血管生成和骨折愈合,被人臍靜脈內皮細胞和前成骨細胞吸收,并導致增值和遷移改善,這可能是由于BMP-2/Smad1/Runx2和HIF-1α/VEGF信號通路的激活[22]。來自BMSC的含MALAT1的外泌體通過介導microRNA-34c/SATB 2軸促進成骨細胞中SATB2的表達,從而緩解骨質疏松癥。攜帶microRNA-122-5p的骨髓MSC來源的外來體通過下調RTK/Ras/MAPK信號通路來下調SPRY2并增加RTK活性來促進成骨細胞增殖和分化[24]。骨組織常規3 D-Exos培養顯示,3 D BMSC-Exos可通過激活HMGB 1/AKT通路促進內皮細胞增殖和遷移,形成血管腔,促進血管生成,3 D BMSCExos有望成為人類醫學研究領域中促進血管生成的潛在治療方法[25]。Zhang 等[26]的研究首次表明BMMSC-Exos可以促進大鼠骨不連模型中的血管生成和骨生成,體外實驗結果表明,BMMSC-Exos可通過激活BMP-2/Smad 1/RUNX 2信號通路促進成骨分化,還能促進血管內皮細胞的功能,體內實驗結果表明,BMMSC-Exos可明顯促進血管生成。

綜上所述,BMSCs-Exos參與骨重建、成骨細胞增殖分化形成、血管內皮細胞的生成與分化、各種機體免疫調節以及骨炎癥反應的生理病理過程,同時也從各種研究以及途經證明BMSCs-Exos將會是臨床上治療骨質疏松癥的潛在指標,具體的作用機制以及利弊反應還需要我們進一步研究與探討。

2.2.2成骨細胞外泌體:成骨細胞體內分化是人體骨折愈合的重要過程,是各種交叉因素的結果。目前已有研究證明TNF-α可通過多種機制抑制成骨細胞的骨形成功能,包括與其受體和死亡受體的相互作用。因此,推測TNF-α誘導的成骨細胞凋亡可能與骨量丟失有關,導致骨質疏松癥,迫切需要新的治療策略來有效抑制TNF-α誘導的細胞毒性和凋亡,以治療骨質疏松癥[27]。鑒于BMSCs-Exos在骨再生治療中的作用,筆者研究了BMSCs-Exos是否能減弱TNF-α誘導的細胞毒性和凋亡,結果顯示TNF-α依賴性地增加miR-146 a的表達,降低細胞活力,促進細胞凋亡,如增加caspase-3,裂解caspase-3和Bax表達。TNF-α通過上調caspase-3和Bax的表達,抑制MC3T3-E1細胞增殖,誘導細胞凋亡。進一步的實驗顯示,Rtn4-Exos通過海綿狀miR-146a減弱TNF-α誘導的細胞毒性和凋亡,提示Rtn 4-Exos可能作為治療TNF-α誘導的骨質疏松癥的有前景的候選物[27]。Xiong等[28]研究表明SIK2和SIK3是miR-5106的靶基因,從而強調了miR-5106在介導成骨細胞分化中的機制作用;當下調時,SIK2和SIK3不再能夠抑制BMSCs的成骨細胞分化,從而加速體內骨折愈合。據報道研究探索,來源于礦化成骨細胞和牙髓細胞的外泌體可促進成骨和成牙分化,中晚期成骨細胞分泌的外泌體,能夠促進成骨形成[29]。Yang等[30]研究表明來自成骨細胞的外泌體也反向調節MSCs的分化,MSCs攝取成骨細胞外泌體可增加其Runx2和Osterix的表達,從而促進干細胞的成骨分化。Narayanan等[31]研究表明,小鼠體內來自成骨細胞前體細胞的外泌體通過miRNA干擾骨髓基質細胞的成骨分化,骨髓基質細胞攝取來自礦化前成骨細胞的外泌體可通過抑制Axin 1表達和增加β-catenin表達激活Wnt信號通路,促進骨髓基質細胞的成骨分化。因此,促進成骨細胞的細胞增殖和抑制細胞凋亡似乎有希望預防和臨床治療骨質疏松策略。

2.2.3破骨細胞外泌體:骨重建是骨生成和破骨細胞生成之間的動態平衡。破骨細胞主要負責骨的分解和吸收,而成骨細胞則負責體內新骨形成,同時破骨細胞還可以刺激骨形成,從而導致合成代謝的影響。破骨細胞衍生的外泌體的生物學活性包括破骨細胞生成的調節和破骨細胞-成骨細胞間的通訊。由于破骨細胞衍生的外泌體具有調節破骨細胞和成骨細胞的潛力,它們在骨質疏松癥和其他骨代謝疾病中的應用目前正在研究中[32]。

越來越多的研究報道表明成骨細胞祖細胞也能感受破骨細胞分泌的或在細胞膜上表達的破骨細胞衍生信號以促進成骨分化。例如,破骨細胞來源的外來體miR-214-3p和骨細胞來源的外來體miR-218均可調節成骨分化[33]。Liang等[34]研究通過一系列的體外和體內實驗,確定破骨細胞分泌的外泌體中的miR-324能夠轉移到原代間充質干細胞(MSCs)中,促進其向成骨細胞分化,從而提出了一種新的miRNA介導的破骨細胞-成骨細胞偶聯模式。Liang等[34]同時使用miRNA微陣列分析鑒定了miR-324在破骨細胞源性外泌體中高表達,體外和體內研究均表明miR-324顯著促進成骨分化,miR-324通過靶向ARHGAP1(成骨分化的負調節因子),顯著誘導MSCs體外成骨分化和礦化[34]。綜上所述,成熟破骨細胞釋放的含miR-324的外泌體在成骨分化的調節中發揮重要作用,并可能橋接破骨細胞和MSCs之間的偶聯,以上研究表明破骨細胞來源的外泌體中的miR-324促進MSCs的成骨分化。

眾所周知,骨細胞和成骨細胞是RANKL和骨保護素的主要提供者,因此不僅對破骨細胞形成的調節至關重要,而且它們同時協調和維持骨吸收和骨形成之間的平衡[35]。攜帶RANK的破骨細胞外泌體可以結合成骨細胞表面活化轉錄因子Runx2,從而促進骨形成[36]。早期研究表明,成骨細胞通過RANKL和成骨細胞分泌的骨保護素之間的緊密相互作用來調節破骨細胞的分化,相反破骨細胞源性RANK也調節骨生成,并偶聯骨吸收和骨形成[37]。破骨細胞中的相關miRNA被轉移到成骨細胞中并影響成骨細胞分化和骨形成[38]。由此破骨細胞外泌體的促進骨形成和骨重建作用已經明確,但是其作用機制尚未完全明確,還需更多的研究來探索。

2.3 臍帶間充質干細胞與骨質疏松癥的關聯

間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)外泌體促進組織再生和修復,可用于多種疾病的治療;然而,微環境條件對外泌體的影響仍不清楚。據相關研究探索,臍帶間充質干細胞(HUMSC)對骨再生的成骨誘導功能,HUMSC來源的外泌體(Exos)促進新骨形成,并對骨生成和血管生成產生積極影響[39]。HUMSCs通常以無創方式采集,具有較強的再生能力,在再生醫學中具有廣闊的應用前景[40]。最新研究發現,HUMSC-Exos可以再生自體骨髓干細胞(ABMSCs),有效延緩衰老,在治療背景下,HUMSC-EV對ABMSCs的恢復作用增強骨形成、傷口愈合和骨組織的血管生成[41]。Li等[42]的研究強調了HUMSC-Exos通過促進大鼠壞死骨組織中的血管生成而在股骨頭缺血性壞死中的潛在作用。通過miR-21-PTEN-AKT信號通路上調HUMSC來源的外來體中的AKT信號通路和減少大鼠糖皮質激素誘導的骨壞死中的破骨細胞凋亡,外分泌由人HUMSC分泌也可以減少BMSC通過mir-1263細胞凋亡/Mob1河馬不使用的信號途徑,可以有效地防止骨質疏松大鼠的骨量丟失[43]。從機制上講,來源于成骨誘導的HUMSCs的外泌體miRNA參與骨發育和分化,例如破骨細胞分化和MAPK信號通路。hsa-mir-2110和hsa-mir-328-3p的表達隨著成骨分化的延長而逐漸增加,并調控與骨分化相關的靶基因,提示它們可能是外泌體中最重要的成骨調控microRNA[44]。HUMSC外泌體對骨質疏松癥模型小鼠的治療作用,6周后小鼠脛骨和松質骨的MicroCT掃描顯示,在三維圖像中,Exo 1和Exo 2相對于假手術組誘導增加的骨量,在成骨細胞分化培養的微環境中,來源于HucMSC的外泌體能夠顯著促進成骨細胞的分化[45]。越來越多的研究證實了HUCMSC-Exos的抗凋亡作用[46]。體外實驗結果表明,人臍帶華頓膠質MSC-Exos(hWJMSC-Exos)能促進骨髓間充質干細胞(BMSCs)的遷移和增殖,促進軟骨細胞的增殖。Jiang等[45]的研究還發現hWJMSC-Exos可促進巨噬細胞向M2表型極化,hWJMSC-Exos可增強ACECM支架的作用,促進骨軟骨再生,此外,microRNA(miRNA)測序證實hWJMSC-Exos含有多種miRNA,能夠促進透明軟骨的再生,不管Exos來源于哪種MSCs,MSC-Exos在促進BMSC和軟骨細胞增殖和遷移中的作用可能是普遍的,hWJMSC-Exos可促進骨軟骨再生。這種作用可能歸因于Exos對關節腔炎癥的抑制和Exos miRNA對軟骨ECM合成的促進。臍帶間充質干細胞外泌體可以促進骨形成以及血管形成,而且可以無創式采集,具有很強的增生能力,可以作為治療骨質疏松治療的一個潛在生物靶點。

3 結論

外泌體是近年來醫學領域中出現的一種新的生物學元件。近年來研究表明,不同來源的外泌體均可通過蛋白質、脂質和核酸(mRNA、miRNA、lncRNA等)調控成骨細胞和破骨細胞的增殖和分化,對椎間盤退變、肌腱再生以及心血管系統和神經系統疾患有顯著的治療作用,可能用于創傷修復、心血管系統保護、神經損傷治療和臨床診斷。外泌體通過內吞作用進入靶細胞發揮生物活性作用,表現出與來源干細胞相似的能力。

綜上所述,本文主要闡述了不同來源的外泌體在防治骨質疏松癥治療方面的應用機制。迄今為止,外泌體治療骨質疏松癥具有很大的優越性,同時具備更高的安全性,而且外泌體作為理想載體,可以更加準確以及高效率的穿透細胞膜傳遞藥物和基因分子物質。但是通過各種途徑提純出的大量的外泌體無法進行長時間的保存,而且不同來源外泌體對于治療骨質疏松的機制與信號通路各不相同,骨重建和信號級聯背后的分子機制尚不清楚,本研究對各種干細胞來源的外泌體針對骨質疏松癥的治療的研究還遠遠不夠深入,外泌體在骨質疏松癥方面的研究前景十分廣闊,這需要未來共同努力探索。