超聲對高濃度大豆分離蛋白結構和酶解產物抗氧化活性的影響

徐晨晨，楊志艷，祝寶華，李曉暉,2,3,*

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農業部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306）

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是低溫條件下以脫脂大豆粕為原料生產的蛋白、含量在90%以上的大豆蛋白，具有成本低、蛋白含量高等特點，已被廣泛應用于食品加工中。但因功能特性不理想、含脹氣因子及不良風味等因素，限制了其在食品領域中的應用[1]。大豆分離蛋白最常用的改性方法是酶法，但酶法反應時間長，生產效率低，限制了高活性功能肽的產生[2]。為了促進蛋白質改性進程及提高酶解產物的抗氧化活性，非熱加工技術已被用于改變大豆分離蛋白的功能特性。

超聲作為一種綠色的非熱加工技術，被廣泛應用于蛋白質改性中，由于空化現象，會引起機械效應以及熱和化學效應，從而改變蛋白質的結構，改善功能特性[3-4]。代世成等[5]將大豆分離蛋白（1%）超聲預處理后，結果表明非共價/共價復合物中大豆分離蛋白的二級結構發生改變，與未處理的大豆分離蛋白樣品相比，β-轉角和無規卷曲相對含量增加，α-螺旋和β-折疊相對含量下降，色氨酸和酪氨酸基團暴露增多，大豆分離蛋白結構變得更加舒展及松散，且抗氧化能力顯著提升。Yan 等[6]超聲處理大豆分離蛋白（3%）后，大豆分離蛋白的α-螺旋和β-折疊增加，從而增加了大豆分離蛋白的柔韌性和巰基含量，并展開了其三級結構。

雖然超聲處理技術可以改善大豆分離蛋白的分子結構，但目前報道的超聲處理大豆分離蛋白常規濃度在1%～12%之間，這導致后續酶解不利于提高終產物濃度和生產效率。本文中高濃度指濃度在16%～20%之間，與常規濃度相比，高濃度條件下可以提高單位設備生產產能，反應加熱冷卻及產物濃縮干燥能耗少，降低成本。然而迄今為止，尚未見超聲應用于高濃度大豆分離蛋白改性的研究報道。因此，本文研究了超聲處理高濃度大豆分離蛋白的可行性，通過SDS-PAGE、傅立葉變換紅外光譜、熒光光譜和熒光探針等檢測手段，對蛋白分子結構進行表征，同時，利用堿性蛋白酶酶解大豆分離蛋白制備得到大豆肽，并評價酶解產物抗氧化功能，以期為高濃度大豆分離蛋白超聲改性和酶解工藝開發提供新的技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPI（蛋白含量95%） 河南金晶生物科技有限公司；堿性蛋白酶（酶活2.0×105U/g） 南寧東恒華道生物有限公司；十二烷基硫酸鈉（SDS）、過硫酸銨、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、Tris 等分析純、蛋白Marker、R-250 考馬斯亮藍染色液、5×上樣緩沖液（Loading Buffer） 上海生工生物工程有限公司；8-苯胺-1-萘磺酸（ANS） 上海麥克林生化科技有限公司；三氯乙酸、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅等 上海國藥集團。

JX-950D 超聲波細胞破碎儀 北京冬歌博業生物科技有限公司；F-7100 熒光分光光度計、LA-8080超高速氨基酸自動分析儀 日本日立公司；Spotlight 400 傅里葉變換紅外光譜儀 英國PerkinElmer 公司；LYNX 4000 冷凍離心機 賽默飛世爾科技（中國）有限公司；KJELTEC 8400 全自動凱氏定氮儀蘇州福斯賽諾分析儀器；CHRIST ALPHA1-2 真空冷凍干燥機 美國Marin Christ 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超聲處理不同濃度SPI 按照前期超聲工藝優化條件（超聲功率300 W，20 min），分別采用去離子水配制4%、8%、12%、16%和20%濃度的樣品溶液進行超聲預處理，分別記為UP-4、UP-8、UP-12、UP-16、UP-20，以未超聲預處理濃度4%為對照，記為WP。

1.2.2 超聲處理后SPI 酶解液的制備 將超聲處理不同濃度SPI 分別稀釋成4%，調節溫度和pH 至最適條件，加入堿性蛋白酶。酶解4 h 后于90 ℃滅酶15 min，冷卻至室溫于10000 r/min，4 ℃離心20 min。分別記為EUP-4、EUP-8、EUP-12、EUP-16、EUP-20。以未超聲處理為對照，記為EWP。收集上清液，冷凍干燥備用。

1.2.3 SDS-PAGE 測定 參照李楊等[7]方法并稍作修改，配制3 mg/mL 的樣品與5×Loading Buffer 按4:1 比例混合均勻，濃縮膠和分離膠濃度分別為4%和12%，上樣量8 μL。

1.2.4 傅里葉變換紅外光譜測定 參照Subasi 等[8]方法，采用Spotlight 400 傅里葉變換紅外光譜儀對不同超聲處理后SPI 進行紅外光譜測定。

1.2.5 熒光光譜測定 根據Huang 等[9]并進行了修改。采用0.01 mol/L（pH7.4）磷酸鹽緩沖液配制成0.4 mg/mL 的樣品溶液。在熒光分光光度計中于290 nm 處激發，300～460 nm 發射，在5 nm 的恒定狹縫下掃描樣品溶液并記錄發射光譜。

1.2.6 表面疏水性測定 參照Wang 等[10]實驗方法并稍作修改，將超聲處理不同濃度SPI 凍干后用0.01 mol/L pH7.4 Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液稀釋至2、4、6、8、10 mg/mL 濃度，取20 μL 的ANS 緩沖溶液加入4 mL 上述配制的水解液混合，立即搖勻，在熒光分光光度計中于390 nm 激發、發射波長400～650 nm 檢測發射熒光強度。用熒光強度對蛋白水解液濃度作圖并進行線性回歸，以線性回歸斜率作為表面疏水性。

1.2.7 多肽含量測定 參照GB/T 22729-2008《海洋魚低聚肽粉》[11]測定方法。采用KJELTEC 8400 全自動凱氏定氮儀測定樣品中酸溶蛋白質水解物含量，L-8080 氨基酸自動分析儀測定樣品中游離氨基酸含量。多肽含量X1計算如公示（1）：

式中：X1，多肽含量（以干基計算），%；X2，酸溶蛋白質水解物含量（以干基計算），%；X3，游離氨基酸含量（以干基計算），%。

1.2.8 分子量測定 參照GB/T 22492-2008《大豆肽粉》[12]測定方法并稍加修改。色譜條件：色譜柱TSKgel G2000SWXL（7.8 mm×300 mm），進樣量10μL，檢測波長220 nm，溫度30 ℃，流動相為乙腈:水:三氟乙酸=450:550:1，流速0.5 mL/min。樣品經0.22 μm微孔濾膜處理進行測定。

1.2.9 游離氨基酸（FAA）組成測定 將0.2 g 酶解凍干粉與15 mL 5% TCA 混合，均質，超聲5 min，靜置2 h，4 ℃ 10000 r/min 離心15 min，吸取上清液5 mL，用NaOH/TCA 調pH 至2.0，定容，過0.22 μm 濾膜，得到透過液于氨基酸自動分析儀中進一步分析氨基酸組成。

1.2.10 抗氧化活性測定

1.2.10.1 DPPH 自由基清除率測定 參考許瑞如等[13]的測定方法并略做改動。配制不同質量濃度的樣品溶液（1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0 mg/mL）取1mL 與含2 mL 0.2 mmol/L DPPH 的95%乙醇置于試管中振蕩，混勻，黑暗處放置30 min 后，在517 nm 處測定吸光度。計算公式如（2）所示：

式中：A樣品，1 mL 樣品與2 mL DPPH 反應后的吸光度；A對照，1 mL 蒸餾水與2 mL DPPH 反應后的吸光度；A空白，1 mL 樣品與2 mL 95%乙醇反應后的吸光度。

1.2.10.2 羥基自由基清除率測定 參考李煦等[14]的測定方法并略做改動。配制不同質量濃度的樣品溶液（1.0、2.0、3.0、4.0 和5.0 mg/mL），取1 mL 依次加入2.25 mmol/L 硫酸亞鐵、9 mmol/L 水楊酸甲醇溶液、8.8 mmol/L 過氧化氫溶液各1 mL，37 ℃條件下放置30 min，4000 r/min 離心5 min，在510 nm 處測上清液的吸光度，公式如下：

式中：A1，添加樣品時的吸光度；A2，水楊酸甲醇溶液和過氧化氫溶液均替換成甲醇時的吸光度；A0，樣品替換成同體積甲醇的吸光度。

1.2.10.3 還原能力測定 參照張雨[15]測定方法并略作修改，取不同質量濃度的樣品液1.0 mL，加入1%的鐵氰化鉀、PBS 緩沖液（pH6.6）各1 mL，在50 ℃的水浴鍋中靜置加熱20 min，快速冷卻后加入10%的TCA（三氯乙酸）1 mL，混勻后6000 r/min離心5 min，取1 mL 的上清液，加入等體積的蒸餾水和0.05%三氯化鐵，混合均勻在700 nm 測吸光度，一定程度上吸光度值與還原能力成正比。

1.3 數據處理

試驗重復3 次、取平均值加減標準差，SPSS 26 軟件進行顯著性分析（P＜0.05），PeakFit 4.12 軟件對紅外吸收曲線進行擬合處理，采用Origin 2022b軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 超聲處理對不同濃度SPI 結構的影響

2.1.1 SDS-PAGE 分析 SDS-PAGE 電泳圖可以觀察超聲處理大豆分離蛋白的分子量及蛋白組成變化，圖1 為不同濃度SPI 超聲處理后取相同濃度進行還原性SDS-PAGE 電泳圖譜。在所有處理中均顯示了分子量分別為20、33、50 和85 kDa 的蛋白條帶。與對照組相比，超聲處理的SPI 之間的電泳圖譜沒有明顯變化，說明在超聲功率300 W，20 min 處理下不同濃度SPI 的一級結構沒有變化。該結果與李楊等[7]的研究結果一致，即超聲處理條件后沒有形成二聚化。張淑艷等[16]發現超聲處理下無論花生蛋白濃度（5%～15%）如何變化，均不能使花生蛋白分子酰胺鍵斷裂，并且在更高超聲強度下處理也是如此。

圖1 超聲處理不同濃度 SPI 的 SDS-PAGE 圖譜Fig.1 SDS-PAGE spectra of SPI at different concentrations by ultrasound treatment

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜分析 傅里葉變換紅外光譜常用來表征蛋白質的二級結構，圖2 為超聲處理的SPI 在不同濃度下的傅里葉變換紅外光譜圖。結果表明，SPI 濃度4%、8%、12%、16%、20%進行超聲處理后，酰胺I 帶的峰位分別從WP 組（對照）的1630.43 cm-1變為1636.37、1635.9、1635.45、1634.48和1634.43 cm-1，酰胺I 的位置改變表明SPI 的二級結構已經發生了轉變[17]。為了進一步獲得有關二級結構變化的信息，在表1 中計算了α-螺旋，β-折疊，β-轉角和無規則卷曲的比例。與WP 相比，隨著濃度增加，α-螺旋含量降低，β-折疊含量先增加后降低，β-轉角含量先降低后增加，無規則卷曲總體變化較小，說明超聲改變了局部氨基酸殘基和分子不同部分之間的相互作用，促進了蛋白質分子的結構轉變。尤其在16%高濃度下最為顯著（P＜0.05），其中，UP-16 樣品的β-折疊含量達到最高43.2%，β-折疊含量的增加有助于暴露蛋白質的疏水區域。而α-螺旋含量的變化隨著超聲處理SPI 濃度增大而減少，這使得蛋白二級結構趨向于展開，這與Zhang 等[18]研究超聲處理酪蛋白觀察到的結果類似。因此，在濃度16%時可以通過超聲的空化作用削弱維持蛋白質穩定性的氫鍵，使蛋白結構由有序轉變為無序，更有利于后續酶解時酶切位點的暴露。

表1 超聲處理不同濃度SPI 的二級結構分布Table 1 Secondary structure distribution of SPI at different concentrations by ultrasound treatment

圖2 超聲處理不同濃度SPI 的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 Fourier transform infrared spectra of SPI with different substrate concentrations treated with ultrasound

2.1.3 熒光光譜分析 SPI 含有許多芳香族氨基酸，如酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，在290 nm 激發存在下可以產生固有的熒光光譜。因此，為了獲得更多有關蛋白質結構變化的信息，采用熒光光譜技術研究蛋白質的結構和不同條件下蛋白質加工過程中的構象變化。通過監測熒光強度和最大發射波長（λmax）來確定蛋白內部結構的松散程度，由于發射強度與熒光激發幅值成正比，熒光強度的增加進一步說明色氨酸殘基更容易被疏水環境包圍，從而了解蛋白質三級結構的變化[9]。超聲處理不同SPI 濃度的熒光光譜如圖3。與WP 相比，經超聲處理不同濃度SPI 后，λmax時的熒光強度分別從209.8 增加到299.2、332.7、359.9、391.8 和338.9。Zou 等[19]在研究超聲波對雞血漿蛋白水解物的影響時也有類似的趨勢。還觀察到在超聲處理16%高濃度SPI 時，SPI 的λmax由338 nm 減少到336 nm，這種降低表明色氨酸和酪氨酸之間的能量轉移效率的差異，即發生了紅移[20]。此外，UP-20 樣品的熒光強度明顯低于UP-16 和UP-12 樣品,可能的原因是濃度過高SPI 流動性較差，增加了反應體系的粘度系數，導致超聲空化閾值增加，最終減少了空化氣泡的產生，在傳播和擴散過程中增加了聲波的損失[21]，這對蛋白質的改性產生負面影響，導致熒光強度降低。

圖3 超聲處理不同濃度SPI 的熒光強度變化Fig.3 Fluorescence intensity changes of SPI at different concentrations by ultrasound treatment

2.1.4 表面疏水性分析 超聲處理所產生的空化和機械效應，導致蛋白質結構展開，暴露出更多的游離巰基，從而顯示出更高的表面疏水性[22]。對所有樣品的表面疏水性進行測定，如圖4 所示。與WP 組相比296.92±2.1，經過超聲處理樣品的表面疏水性均顯著提高（P＜0.05）。隨著SPI 濃度由4%增加到8%、12%、16%、20%時，SPI 的表面疏水性分別從362.27±3.63 增加到371.25±1.92、470.0±3.54、543.75±6.57和480.45±3.75。而當蛋白濃度過高時（如20%），體系黏度非常高，從而影響空化效應，正如β-折疊含量增加（表1）和熒光光譜（圖3）熒光強度降低。Zhu等[23]報道了SPI 結構中的低α-螺旋和高β-折疊含量表明其柔韌性和表面疏水性同時增加，這可能是因為超聲處理導致更多的疏水基團通過疏水相互作用重新聚合，從而導致蛋白質疏水性降低。同時，蛋白質的疏水性是影響蛋白質水解物ACE 抑制活性和抗氧化活性的重要因素之一[24]，表面疏水性的增加可以提高酶解產物的生物活性。

圖4 超聲處理不同濃度SPI 表面疏水性變化Fig.4 Effect of ultrasonic treatment with different concentrations on the hydrophobicity of SPI surface

2.2 超聲處理不同濃度SPI 的酶解產物分析

2.2.1 多肽含量 超聲處理不同濃度對SPI 酶解產物的多肽含量的影響如圖5 所示。與EWP（未超聲對照組）相比，超聲可顯著提高堿性蛋白酶酶解產物的多肽含量（P＜0.05），隨著超聲處理SPI 濃度的增加，多肽含量呈先增加后降低的趨勢，超聲處理16%高濃度SPI 時多肽含量達到最大值84.27%，而濃度20%時多肽含量下降到76.02%。由此可知，在一定的處理濃度下，超聲可以有效破壞SPI 的細胞壁，加快堿性蛋白酶的酶解，使大分子物質展開、肽鍵斷裂和親水氨基酸殘基的暴露。而在濃度過高的情況下，超聲對SPI 的結構作用較小，從而影響其超聲對酶解產物的效果，這也和超聲處理對不同濃度SPI 結構的結果相互印證。Wang 等[21]研究玉米蛋白表明，超聲處理能夠顯著提高酶解產物中的多肽含量。而Chen 等[25]在高固形物濃度研究中則表明SPI 濃度越高蛋白回收率越低，與本實驗結果趨勢一致。

圖5 超聲處理不同濃度SPI 對酶解產物多肽含量的影響Fig.5 Effect of different concentrations of SPI on the peptide content of enzymatic digestion products by ultrasonic treatment

2.2.2 分子量分布 多肽分子量分布是評價酶解產物質量的一個重要指標，它與酶解產物的活性高度相關。表2 為超聲不同濃度SPI 對酶解產物分子量分布的影響?？梢钥闯龃蠖苟嚯姆肿恿恳孕∮?000 Da為主要成分，占比88%左右，200～1000 Da 占80%以上，3000～5000 Da 的范圍變化較小。與EWP 相比，超聲處理8%～16%濃度SPI 更有利于200～1000 Da分子量的肽段釋放。這表明超聲處理可能導致SPI的疏水殘基或基團暴露、解產物結構的松散，使蛋白內部的酶切位點大量暴露，增加了堿性蛋白酶和酶解部位的接觸，有利于酶解反應。然而，超聲處理20%濃度SPI 后，200～1000 Da 的分子量明顯下降，可能是由于超聲高濃度條件下蛋白體系粘度大，超聲處理不均勻，限制了大分子物質的降解，不利于酶解產物中小分子肽的產生[26]。對比其他人SPI 酶解的結果進行分析[27]，本研究得到的分子量范圍與目前報道的水平接近。

表2 超聲處理不同濃度SPI 對酶解產物分子量分布的影響Table 2 Effect of different concentrations of SPI on the molecular weight distribution of enzymatic digestion products by ultrasonic treatment

2.2.3 游離氨基酸（FAA）組成分析 從表3 中可以看出超聲處理不同濃度SPI 酶解產物的FAA 組成和含量的差異。由于該方法為酸處理法，測定時樣品的濃度低，導致半胱氨酸、亮氨酸、組氨酸、脯氨酸沒有檢出，但必需氨基酸（6 種）的含量超過70%。EWP、EUP-4、EUP-8、EUP-12、EUP-16 和EUP-20處理得到酶解產物總FAA 含量分別為30.14、30.02、43.14、45.32、45.96 和37.26 mg/g，EUP-16 組總含量高于其他組。同時，SPI 酶解產物中含有大量游離疏水氨基酸（30.79 mg/g），經超聲處理后的游離疏水氨基酸含量增加了11.44 mg/g。這是因為在合適的蛋白濃度下超聲的空化效應、機械效應和瞬時高溫高壓才能更好的破壞蛋白質肽鏈，以及對蛋白質結構的破壞可以使更多酶作用位點暴露，從而生成大量FAA。Koláková等[28]研 究 表 明，這 些 必 需FAA含量和疏水性氨基酸的增加從理論上可以提高產品的營養價值。另外，研究表明氨基酸在抗氧化反應中起重要作用，其作為電子供體，能夠直接與自由基結合，形成有利于發揮抗氧化活性的構象[29]。疏水性氨基酸殘基如Val 或Leu 可以增加水-脂質界面的多肽，有利于清除脂質階段產生的自由基。經超聲處理后（EUP-16 組），酶解產物中Leu、Met、Tyr、Phe 等疏水氨基酸含量顯著（P＜0.05）增高。Cheison 等[30]認為含疏水性氨基酸殘基的氨基酸的個數越多，則多肽的抗氧化活性越高。

表3 超聲處理不同濃度SPI 對酶解產物FAA 組成的影響Table 3 Effect of different concentrations of SPI on the FAA composition of enzymatic digestion products by ultrasound treatment

2.2.4 抗氧化活性分析 SPI 酶解產物的抗氧化活性受酶解程度、分子量分布和氨基酸種類的影響。本文使用三種不同的方法來評估酶解產物的抗氧化活性，如圖6 所示。與EWP（未超聲對照組）相比，隨著質量濃度的增加，經超聲獲得的酶解產物中DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率和還原能力都顯著增加（P＜0.05）。此外，在同一濃度下，超聲16%高濃度SPI 酶解產物中DPPH 自由基清除率、羥自由基清除率和還原能力均顯著高于其他組對應數值（P＜0.05）。對質量濃度和清除率之間作回歸方程并計算半抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）。由圖6a 可知超聲處理4%～20%濃度SPI 的酶解產物對DPPH 的IC50值分別為3.74、3.21、2.0、1.6和2.325 mg/mL，比未超聲（IC50=4.16 mg/mL）顯著（P＜0.05）降低，說明超聲處理有助于在酶解過程中，將大分子量部分蛋白質降解為小分子量部分，DPPH自由基的更高吸收能力可能是比未超聲處理中存在更大量的疏水性殘基，因為疏水性可以改善多肽與DPPH 分子的相互作用[31]。由圖6b 可知，其酶解產物對羥自由基清除率的趨勢與DPPH 大致相同。隨著超聲SPI 濃度增加樣品的羥自由基清除率呈現先增加后減少的趨勢，且在超聲處理16%高濃度SPI 的IC50值為1.67 mg/mL，比未超聲組（IC50=4.53 mg/mL）明顯降低2.86 mg/mL（P＜0.05）。圖6c是酶解產物對還原能力的影響，在質量濃度范圍內，超聲16%高濃度SPI 得到的吸光度值從0.357 上升到0.960，4%濃度SPI 得到的吸光度值從0.194 上升到0.618，未超聲的吸光度值從0.120 上升到0.541，說明在相同的酶解濃度和條件下，16%高濃度SPI 經超聲后，酶解產物的抗氧化活性高于其余組的抗氧化活性。

圖6 超聲處理不同濃度SPI 對酶解產物抗氧化活性的影響Fig.6 Effect of different concentrations of SPI on the antioxidant activity of enzymatic digestion products by ultrasound treatment

抗氧化活性分析結果表明16%高濃度SPI 經過超聲處理后，其抗氧化活性最高，推測與其酶解產物200～1000 Da 分子量增加，含有較多的游離氨基酸（FAA）有關。后續將進一步分析其酶解產物中200～1000 Da 組分中抗氧化肽的組成、篩選和鑒定新型抗氧化大豆肽。

3 結論

本研究探討了超聲對高濃度SPI 結構的影響及其酶解制備大豆肽的效果。SDS-PAGE 表明，無論蛋白濃度高低，超聲處理都未使SPI 一級結構發生改變；二級結構表明，濃度增加會影響β-折疊和α-螺旋含量，在16%濃度SPI 超聲處理后β-折疊含量達到最高43.2%，β-折疊含量的增加有助于暴露蛋白質的疏水區域，α-螺旋含量會使蛋白分子柔性增加，結構變松散，疏水性增強，在一定程度上提高了超聲改性效果；熒光光譜強度和表面疏水性增加進一步說明，增加SPI 濃度是超聲導致蛋白內部結構的松散程度和更多疏水基團暴露的原因。經超聲改性后在相同4%底物濃度SPI 進行酶解，結果表明，在超聲處理16%濃度SPI 后，酶解產物多肽含量最高達84.27%，產物中FAA 含量顯著高于其他濃度的超聲處理。同時，對酶解產物分子量的分析表明，在8%～16%濃度SPI 超聲處理后，有利于200～1000 Da 低分子量肽段的生成。在對酶解產物抗氧化分析中發現，16%濃度SPI 的超聲處理使得酶解產物中具有更高的抗氧化活性。

綜上表明，超聲時選擇合適的SPI 蛋白底物濃度十分重要，16%高濃度SPI 超聲后對后續酶解產物大豆多肽的含量和酶解產物的抗氧化活性具有明顯提高的效果，本研究為高濃度SPI 超聲處理和開發大豆肽酶解技術提供了技術參考。因此，在超聲條件下，選擇合適的蛋白濃度，可以達到對蛋白分子結構特性改性的目的，但關于超聲對高濃度蛋白結構與活性之間的構效關系及其具體作用機制仍需進一步探究。