甲型副傷寒沙門氏菌HmpA 蛋白的表達純化及生物學特征預測

王 磊，劉小草，董 雨，王雪婷，柴徵微，李 吉，丁愛軍，張維明，曾韋錕

（昆明學院醫學院，云南昆明 650214）

腸熱癥由傷寒沙門氏菌、副傷寒沙門氏菌（甲、乙、丙）所引起，主要通過污染的水源和食物而爆發流行，不良的衛生條件和生活習慣是疾病發生的主要原因，但是隨著人員交際的增加，全球腸熱癥病發率逐漸成為大部分國家突出的衛生問題[1-3]。近年來，傷寒沙門氏菌感染占比呈下降趨勢，而甲型副傷寒沙門氏菌（后簡稱副甲菌）在某些地區感染占比則呈現上升趨勢[4-5]。據調查，近年來云南、廣西、湖南、貴州、福建和廣東6 個省份傷寒、副傷寒的發病率均顯著高于全國平均水平[6]。雖然云南省的傷寒、副傷寒的發病率總體呈逐年下降趨勢，但患病率在全國仍處于較高的水平且多年位居第一[7-8]。副甲菌感染引起的疾病在臨床上以持續高熱，相對緩脈，肌肉酸痛，特征性中毒癥，脾腫大，玫瑰疹與白細胞減少等為特征，主要并發癥則包括腸出血、腸穿孔等[9-12]。因此探究副甲菌逃脫宿主免疫殺傷的機制十分必要。

多種生物體利用NO 來抵抗微生物感染，NO 通過促進亞硝化應激[13-15]和抑制有氧呼吸鏈中的血紅蛋白來對微生物產生細胞毒性[16-17]。HmpA 蛋白是細菌體內hmpA基因產生的NO 雙加氧酶[18]，其在宿主一氧化氮合酶產生ROS 和NO 時在細菌體內表現出較高活性[19-21]，功能主要是通過將宿主產生的殺傷性NO 以一定方式降解為對菌體無害的硝酸鹽，如在大腸桿菌中催化的主要反應是通過雙加氧酶機制轉化O2和NO 形成硝酸根離子。但有研究顯示該蛋白降解NO 的效率在低氧或缺氧環境中可能受到限制[22]，即在缺氧或低氧條件下，HmpA 蛋白的活性會顯著降低[23]。但總的來說，在細菌于宿主體內的免疫逃避過程該蛋白發揮至關重要的作用。目前關于甲型副傷寒沙門氏菌體內HmpA 蛋白的功能、結構及基本理化性質尚無清晰報道。為了進一步研究副甲菌中HmpA 蛋白的基本生物學信息，本研究以甲型副傷寒沙門氏菌CMCC 50973 菌株為模板，克隆hmpA基因并構建了原核表達載體，誘導表達并純化了HmpA 蛋白[24-25]；并通過生物信息方法對該蛋白相關的多個重要理化性質進行分析[26-27]。這為后續探究甲型副傷寒沙門氏菌體內HmpA 蛋白的免疫學特性與降解宿主細胞產生的殺傷性NO 機理方面的影響提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲型副傷寒沙門氏菌CMCC 50973、pNdeI 質粒（本實驗室從pET-28a（+）質粒改造而來）、大腸桿菌BL21（DE3） 本實驗室保存；pMD19T Vector、T4 DNA 連接酶、DNA 聚合酶、dNTPs、核酸分子質量Marker 寶生物工程有限公司；質粒小量提取試劑盒、微量瓊脂糖DNA 回收試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司；PAGE 凝膠快速制備試劑盒（10%）、雙色預染蛋白Marker 上海雅酶生物醫藥科技有限公司；ULtraSignal 超敏ECL 化學發光底物、限制性內切酶NdeⅠ及XhoⅠ 賽默飛世爾科技公司；小鼠抗His 標簽單克隆抗體 德悅（北京）生物科技有限責任公司；HRP-羊抗鼠IgG、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG） 生工生物工程（上海）股份有限公司；PAGE 蛋白上樣緩沖液、BeyoBlue?考馬斯亮藍超快染色液 上海碧云天生物科技有限公司；酵母提取物、胰化蛋白胨 英國Oxoid 公司；氨芐青霉素、卡那霉素 BBI 公司；瓊脂糖 基因生物技術國際貿易（上海）有限公司；Tris/甘氨酸/SDS 電泳緩沖液（10×）、10×電泳轉移緩沖液（轉膜液）（粉劑）、10×TBST 緩沖液（粉劑）、10×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（粉劑）、1×PBS 緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；PCR 擴增引物 昆明擎科生物科技有限公司；0.22 μm 無菌濾膜、0.45 μm 無菌濾膜 Minipore 公司；Histrap 1 mL 預裝柱 美國GE 公司。

Nano-200 核酸蛋白測定儀 杭州奧盛儀器有限公司；GZX-DH 電熱恒溫干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司； Bio-base BSC-1500 II A2-X 生物安全柜 濟南鑫貝西生物安全柜；GI-1 發光成像系統上海天能有限公司；Neo 13R 高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；D3024 臺式高速微量離心機、D1008 掌上離心機 美國賽洛捷克科技有限公司；GI-1 紫外凝膠成像分析系統 通寶達成有限公司；HQ45Z 恒溫搖床儀 武漢中科科儀技術發展有限責任公司；EPS 200 電泳儀雙板垂直蛋白電泳系統上海天能科技有限公司；JY92-IIN 超聲波細胞破碎儀 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因的克隆 以CMCC 50973 基因組為模板設計引物hmpA-F、hmpA-R（表1），為了將片段定向克隆至pNdeI 載體上的NdeI 和XhoI 之間并與XhoI 位點后的6 His 標簽融合，分別在上下游引物的5’端引入NdeI 或XhoI 酶切位點，PCR 擴增hmpA基因片段，PCR 程序為：94 ℃（5 min）；94 ℃（30 s），57 ℃（30 s），72 ℃（70 s）共30 個循環；72 ℃（5 min）。PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳并掃描。

表1 PCR 引物Table 1 PCR primers

1.2.2 亞克隆pMD19T-hmpA的構建及鑒定 將1.2.1 獲得的PCR 產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，將hmpA基因片段利用微量瓊脂糖DNA 回收試劑盒進行回收，后與pMD19T Vector 載體16 ℃連接18 h。-80 ℃取出DH5α感受態細胞在冰水浴中完全融化后加入連接產物，冰水浴靜置5 min；42 ℃熱激90 s；迅速冰水浴靜置2 min；而后加入液體LB 500 μL，37 ℃，200 r/min，培養30 min；將培養液10000 r/min 離心1 min，吸棄培養基剩余約60 μL重懸菌體后，均勻涂于氨芐抗性平板上37 ℃過夜培養18 h。挑取單克隆菌落至帶有氨芐抗性（30 μg/mL）的3 mL LB 培養基中37 ℃，200 r/min 培養18 h 后利用質粒小量提取試劑盒提取質粒，進行37 ℃，30 min 的NdeⅠ、XhoⅠ酶切鑒定，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，并觀察酶切結果。鑒定為正確的質粒，送昆明擎科生物科技有限公司進行測序，測序正確的載體命名為pMD19T-hmpA。

1.2.3 表達載體pNdeI-hmpA的構建及鑒定 將DH5α轉化提取的pNdeI 質粒及測序正確的pMD19ThmpA質粒分別進行37 ℃，40 min 的NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，微量瓊脂糖DNA 回收試劑盒回收雙酶切產物，將回收產物用T4 DNA 連接酶16 ℃連接18 h后轉化至DH5α感受態細胞，轉化步驟同1.2.2。挑取轉化后的單菌落至帶有卡那抗性（30 μg/mL）的3 mL LB 培養基中37 ℃，200 r/min 培養18 h，提取質粒，進行37 ℃，30 min 的NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，并觀察酶切結果。構建正確的載體命名為pNdeI-hmpA。將此質粒轉化入大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞獲得重組表達菌pNdeI-hmpA/BL21（DE3）同1.2.2。

1.2.4 HmpA 蛋白的誘導表達與純化 將pNdeIhmpA/BL21（DE3）原核表達菌株及空載體菌劃線獲得單克隆，挑取單克隆接種于5 mL 含有50 μg/mL卡那霉素的 LB 培養液中，37 ℃搖床培養過夜。第2 d 將過夜培養的兩種表達菌株按1%（100 μL）的比例轉種于10 mL（50 μg/mL）K+LB 培養液中；37 ℃搖床培養待OD600≈0.7 左右時，加入IPTG 至終濃度為1 mmol/L，16 ℃誘導過夜。取1 mL 經IPTG 誘導菌，12000 r/min 離心60 s 棄上清，加入600 μL PBS 重懸菌體再次以12000 r/min 的速度離心60 s棄上清。按1:1 體積比加PBS，冰水浴條件超聲破碎（312 W，工作5 s，間隔10 s，共工作60 min）。破碎完成后，低溫高速離心機4 ℃、2000 r/min，離心10 min；轉移上清至新的EP 管后，4 ℃、10000 r/min離心15 min，沉淀則用100 μL PBS 重懸。分別取上清與沉淀重懸液與上樣緩沖液混合，煮樣15 min 后進行SDS-PAGE 電泳。

在純化目的蛋白前先用5 倍柱體積的無菌水沖洗Ni 柱，然后用平衡緩沖液5 mL 平衡柱子（上清平衡緩沖液：20 mmol/L PB、150 mmol/L NaCl、pH=7.40，沉淀平衡緩沖液：20 mmol/L PB、150 mmol/L NaCl、8 mol/L 尿素、pH7.40），并用0.45 μm 無菌濾膜過濾上清與沉淀重懸液（兩者分別單獨純化）。平衡后將過濾后的上清與沉淀重懸液分批緩慢注入Ni 柱中，隨后用含有咪唑的緩沖液洗柱子，上清洗柱子與洗脫緩沖液為20 mmol/L PB、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L 及1 mol/L 咪唑、pH7.40，沉淀重懸液的洗柱子與洗脫緩沖液為20 mmol/L PB、150 mmol/L NaCl、50 mmol/L 及1 mol/L 咪唑、8 mol/L 尿素、pH7.40，收集純化洗脫的樣品進行SDS-PAGE 電泳。

1.2.5 純化后蛋白的Western blot 分析 重組蛋白經SDS-PAGE[28]后電轉移至聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）上，用10%脫脂奶粉輕搖室溫封閉2 h，TBST 漂洗4 次，每次10 min，加入按1:2000 比例用TPBS 稀釋好的小鼠抗His 標簽單克隆抗體，于4 ℃條件下輕搖過夜后，TBST 漂洗PVDF 膜后并浸洗三次，每次漂洗10 min，再加入按1:10000 比例用TPBS 稀釋好的HRP 標記的羊抗鼠IgG 室溫輕搖1 h 后，用TBST 漂洗PVDF 膜后并浸洗三次，每次漂洗5 min，取ULtraSignal 超敏ECL 化學發光底物（2 種試劑）各0.5 mL 至無菌EP管中（按1:1）混勻，滴加適量稀釋后的發光底物于膜上，成像儀拍照保存。

1.2.6 HmpA 蛋白的生物信息學功能分析 用ExPASy 的ProtParam 軟件分析HmpA 蛋白的基本理化性質；Protscale 在線分析HmpA 蛋白的親水性，TMHMM Server v.2.0 軟件對HmpA 蛋白的跨膜結構進行了氨基酸序列分析；利用SignaIP 5.0 Server軟件對HmpA 蛋白的信號肽預測分析；通過NPS@SOPMA 在線分析軟件對目的蛋白的二級結構進行氨基酸序列分析；采用ExPASy 的SWISSMODEL 蛋白質庫，建立了HmpA 蛋白的三維結構同源模型；采用NCBI 中的CDD（Conserved Domain Database）數據庫通過目的蛋白的氨基酸序列分析其結構域；在NetPhos 3.1 Sever 在線工具中利用目的蛋白的氨基酸序列來分析其磷酸化位點；采用ATRING 1.0 蛋白互作數據庫分析與HmpA 相關蛋白。

2 結果與分析

2.1 亞克隆載體pMD19T-hmpA 的重組構建及鑒定

以副甲菌CMCC 50973 基因組為模板，PCR 擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳可見約1197 bp 的hmpA基因，見圖1A。亞克隆載體pMD19T-hmpA經NdeI 和XhoI 限制性內切酶雙酶切后，行1%瓊脂糖凝膠電泳，可見切出的目的片段（圖1B）。測序結果部分峰圖見圖1C，堿基序列與預期相符。表達載體pNdeI-hmpA經NdeⅠ和XhoⅠ的雙酶切鑒定后，電泳結果如圖1D 所示，可切出目的片段，表明該載體構建成功。

2.2 HmpA 蛋白的誘導表達

將重組pNdeI-hmpA質粒轉入大腸桿菌BL21（DE3）后IPTG 誘導表達，蛋白電泳條帶結果如圖2A所示。誘導前泳道和誘導后泳道的對比發現，誘導后在40～50 kDa 間可見明顯蛋白條帶，說明目的蛋白誘導成功。在16 ℃條件下誘導過夜后，誘導后的pNdeI-hmpA/BL21（DE3）菌株超聲破碎后，分別將離心上清及沉淀進行電泳，結果如圖2B 所示，表明表達載體可同時表達可溶性與包涵體兩種形式的目的蛋白，泳道4 是全菌超聲破碎后的離心沉淀，泳道5 是超聲破碎后的離心上清，兩者比較發現沉淀中的目的蛋白條帶比上清中的目的蛋白條帶粗，以此推測低溫誘導表達時，目的蛋白仍然主要以包涵體形式存在。

圖2 重組菌的IPTG 誘導表達及HmpA 蛋白表達形式鑒定Fig.2 Protein expression of recombinated bacteria after IPTG induced and indentification of expression pattern of protein HmpA

2.3 HmpA 蛋白的純化與Western blotting 鑒定

純化后的蛋白進行SDS-PAGE 檢測，結果如圖3A 所示，純化出的蛋白大小約為44 kDa。經Gel-Pro Analzer 軟件分析，可溶性表達形式純化后的目的蛋白純度約97.3%，包涵體表達形式純化后的目的蛋白純度約71.7%。為了識別HmpA 重組蛋白條帶，克隆設計時在hmpA基因下游添加了6 個組氨酸密碼子，因此表達的HmpA 蛋白C 端帶有6 個組氨酸標簽（Histidine-tag，His-tag），如圖3B 所示，純化后的目的蛋白均可被抗His 抗體檢測到。

圖3 SDS-PAGE 檢測純化后的HmpA 蛋白及Western blot 鑒定Fig.3 SDS-PAGE detection of purified HmpA protein and identification with Western blot

2.4 生物信息學功能分析結果

通過ExPASy 的ProtParam 軟件對HmpA 蛋白進行了分子式預測，其分子式為C1976H3018N540O580S12，相對分子質量為44003.69，理論等電點（pI）為5.56，原子總量為6126；在哺乳動物細胞中的半衰期約為30 h，在酵母中＞20 h，大腸埃希菌中＞10 h。不穩定因子約為28.32，說明其穩定性較高（不穩定因子在40 以下提示蛋白質結構穩定性較好而大于40 提示蛋白質可能不穩定）[29]；總親水指數為-0.268，推測是親水性蛋白；脂肪族指數為80.38（熱穩定性較高）。結果還顯示該蛋白含有396 個氨基酸，其中有4.3%的Ile（I）；8.3%的Leu（L）；1.5%的Trp（W），以及帶正電荷的氨基酸殘基（Arg+Lys，含堿性R 基的氨基酸）的數量為33 個，帶負電荷的氨基酸殘基（Asp+Glu，含酸性R 基的氨基酸）的數量為48 個。詳細情況見表2。

表2 HmpA 蛋白氨基酸占比Table 2 Percentage of protein amino acid of HmpA

利用Protscale 分析HmpA 蛋白親水性，選用Kyte & Doolittle 模式計算方法，將親水性與疏水性峰值分析圖譜間隔設置為21，所得結果見圖4。圖中縱坐標分值大于0 表示疏水性強弱，縱坐標分值小于0 表示親水性強弱。結果顯示目標蛋白的第45 位氨基酸親水性最強（分值為-1.948），第272 位氨基酸疏水性最強（分值為1.186），同時肽鏈的親水區占比多于疏水區占比，提示目標蛋白為親水性蛋白的可能性較大，這和ProtParam 預測的結果相同。

圖4 HmpA 蛋白的親水性分析Fig.4 Hydrophilic analysis of HmpA protein

通過TMHMM Server v.2.0 軟件對HmpA 蛋白的跨膜結構進行了氨基酸序列分析，其中跨膜螺旋值趨于0，所以推測該蛋白沒有跨膜區的結構（圖5）。利用SignaIP 5.0 Server 軟件對HmpA 蛋白是否存在信號肽進行預測分析（信號肽是引導蛋白質進行膜轉移的小分子氨基酸，根據信號肽的存在與否，可預測蛋白是否為分泌型），結果顯示HmpA 蛋白為Sec/SPI 信號肽的概率為1.22%，TAT/SPI 信號肽的概率為0.16%，Sec/SPII 信號肽的概率為0.1%，其他類型的概率為98.52%，綜合上述結果，表明目標蛋白是分泌型蛋白的可能性很低（表3）。采用NCBI中的CDD（Conserved Domain Database）數據庫通過目的蛋白的氨基酸序列分析其結構域，結果顯示HmpA 蛋白含一個結構域，屬于PRK13289 超級家族（圖6）。

圖5 HmpA 蛋白跨膜域預測Fig.5 Prediction of transmembrane domain of HmpA

圖6 HmpA 蛋白的結構域預測Fig.6 Prediction of structural domain of HmpA

表3 HmpA 蛋白的信號肽類型預測Table 3 Signaling peptide type prediction for HmpA proteins

通過在線軟件NPS@SOPMA 對HmpA 蛋白的二級結構進行預測（圖7），其中α-螺旋占42.17%，延伸鏈占16.67%，β-轉角占4.8%，無規則卷曲占36.36%。HmpA 蛋白的三級結構通過ExPASy 的SWISS-MODEL 蛋白質庫預測，模板序列為1gvh.1.A，序列相似度為91.16%，結果如圖8 所示。

圖7 HmpA 蛋白的二級結構預測Fig.7 Prediction of secondary structure of HmpA

圖8 HmpA 蛋白的三維模型Fig.8 3D model of HmpA

在NetPhos 3.1 Sever 在線工具中，利用目的蛋白的氨基酸序列來分析其磷酸化位點。結果顯示HmpA 蛋白具有多個磷酸化位點，其中磷酸化能力超閾值有12 個絲氨酸（Serine），15 個蘇氨酸（Threonine），5 個酪氨酸（Tyrosine），所以HmpA 蛋白共有32 個磷酸化位點（圖9）。采用ATRING11.0 蛋白互作數據庫預測與HmpA 蛋白相關蛋白，圖中每個節點代表一個互作蛋白，若兩個蛋白質之間存在相互作用，則以連線連接，連線的顏色反映了互作類型，包括試驗驗證或預測得到的，也包含直接物理作用、共表達、基因融合等關系[30]。結果顯示，HmpA 在鼠傷寒沙門氏菌中的同源蛋白為hmp（hmp 蛋白在鼠傷寒沙門氏菌體內有氧過程中參與NO 解毒，從而被稱為一氧化氮雙加氧酶），與hmp 蛋白有較緊密聯系的蛋白質有HTH 型轉錄抑制因子NsrR（參與細胞亞硝化應激基因激活的一氧化氮敏感抑制因子）、鐵硫簇修復蛋白YtfE（參與修復被氧化和亞硝酸鹽應激條件破壞的鐵硫簇的含二鐵蛋白）、細胞色素C 亞硝酸鹽還原酶nrfA（催化亞硝酸鹽還原為氨），其他還有同源蛋白DD95_08350 及在其他文章中一起被提及的thiD、thiG、hemE、hcp 等與細菌NO 解毒途徑有關的轉錄因子和酶[31-33]，據此推測HmpA 蛋白的功能與副甲菌降解宿主產生的殺傷性NO 機制通路密切相關（圖10）。

圖9 HmpA 蛋白的磷酸化位點預測Fig.9 Prediction of phosphorylation site of HmpA

圖10 HmpA 蛋白的互作蛋白預測Fig.10 Prediction of interacting protein of HmpA

3 結論

本研究成功構建了pNdeI-hmpA原核表達載體，轉入BL21（DE3）后經IPTG 誘導、親和層析法純化可得到重組蛋白。生物信息學分析結果顯示HmpA蛋白為親水性蛋白，無信號肽、跨膜區域；屬PRK13289超級家族蛋白；二級結構較松散，主要由α螺旋與不規則卷曲構成；含有多個磷酸化位點，與副甲菌體內降解NO 的多種酶、多肽及轉錄因子等關聯，初步驗證了HmpA 蛋白與副甲菌NO 解毒途徑有關，但關于該重組蛋白的體外NO 降解活性、在副甲菌體內產生的機理途徑，以及同宿主細胞的抗原抗體反應分子機制在研究中均未涉及。后續研究將對HmpA 蛋白的體外活性及其對宿主免疫細胞功能的影響做進一步探究，以分析該蛋白在副甲菌感染過程中所起到的作用，為副傷寒疾病的治療及副甲菌的防治提供幫助。

生物信息學分析結果顯示HmpA 蛋白為親水性蛋白，但實驗結果顯示誘導的目的蛋白既有包涵體形式又有可溶性形式，這提示我們在典型的大腸桿菌原核表達系統中，蛋白的兩親性跟目的蛋白的表達形式可能不是互相對應的。本實驗所用到的載體是基于T7 RNA 聚合酶及其強啟動子之間的特異性和轉錄高效性建立，該系列載體誘導目的蛋白表達，同時將大量菌體內資源用于高效率的蛋白表達，且蛋白產量極高。因此在誘導時由于細胞內肽鏈合成過快卻來不及正確折疊進而不能形成天然構象蛋白。同時影響外源基因在大腸桿菌系統中表達的因素還包括目的蛋白的分子質量、培養條件的控制（溫度的選擇和誘導及培養的時間）、密碼子的選用等。后續實驗將從表達載體的選取、誘導表達條件的優化等方面改善以提高HmpA 蛋白的表達效率。