香菇多糖通過IL-6/STAT3/Notch 信號通路調控胰腺癌細胞增殖、遷移及化療敏感性

張 冬，鄧同興，王豐剛，林小博，程杰西，馬永超

（漯河醫學高等專科學校，河南漯河 462002）

胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）是最具侵襲性的消化系統致命癌癥，預后嚴重，死亡率高，5 年生存率小于5%[1]。雖然胰腺癌的發病機制和病因尚未完全闡明，但一些常見的胰腺癌危險因素已被報道，包括吸煙、肥胖、遺傳、糖尿病、飲食，甚至胰腺炎和飲酒。胰腺癌的治療包括手術、放射治療、化療和姑息治療[2]。然而，復雜的胰腺癌手術或聯合治療并不能取得良好的療效，迫切需要更有效的治療方法[3]。而食品來源的活性物質具有毒副作用小等特點，因此，研究香菇多糖對胰腺癌細胞增殖、遷移及化療敏感性的影響及其機制，可以為胰腺癌的輔助治療提供實驗依據。

胰腺癌的發生不僅受到絲氨酸/蘇氨酸激酶11（STK11）、蛋白酶、絲氨酸1/蛋白酶、絲氨酸2 （PRSS1/PRSS2）、Pim-1 等基因突變的高度影響，也受到炎癥細胞、趨化因子和細胞因子為主的微環境的影響[4]。研究顯示，白細胞介素-6（IL-6）與自身免疫性疾病、癌變等有關，并已證明其影響PC 的發生、進展、預后和轉移[5]。研究顯示，Notch 信號通路在癌癥的進展、自我更新中起著重要作用，能調節肝癌細胞的增殖[6]，而且Notch 信號傳導和IL-6 相互作用在肝細胞癌、乳腺癌中作用已經得到證實，能有效的調控癌癥的進展[7-8]。而調節IL-6/STAT3 信號通路能有效調控藥物對癌細胞的化學增敏作用[9]，包括IL-6 通過STAT3/Notch 信號通路調節多發性骨髓瘤細胞系對硼替佐米的耐藥及化學敏感性[10]。

香菇多糖（Lentinan）是從香菇中分離出來的β-（1,3）-葡聚糖多糖，具有低毒和抗腫瘤、抗炎和免疫增強等多種活性，能通過增強宿主的免疫應答（特別是T 淋巴細胞介導的應答間接發揮抗）腫瘤作用[11]。與單純化療相比，香菇多糖聯合化療可顯著延長結直腸癌患者的生存率，改善免疫反應，減少不良反應，表明香菇多糖對抗腫瘤作用具有一定的輔助作用[12]。已有研究顯示，香菇多糖治療胰腺癌具有一定的效果[13]，且胰腺癌組織中，IL-6/STAT3 信號通路和Notch 信號通路均處于激活狀態[14-15]，而香菇多糖能否通過IL-6/STAT3/Notch 信號通路發揮抗癌作用并不明確。本研究重點分析香菇多糖對胰腺癌細胞增殖、遷移及化療敏感性的影響，并分析其機制，為香菇多糖的開發提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

BALB/c 裸鼠 30 只SPF 級5～6 周齡，雄性，體重（16～20 g），購自中國科學院上海動物實驗中心，動物合格證號SCXK（滬）2017-0005。標準動物房飼養，溫度（22±5）℃ , 濕度（57±8）%，光暗交替各 12 h，自由獲得標準的飼料和水；人胰腺癌Capan-1 細胞株 碧云天生物技術有限公司；干香菇 購自漯河市許慎市場；MTT 試劑盒、IL-6 北京索萊寶科技有限公司；兔抗p- STAT3、STAT3、Notch1、Hes1、Ki-67、MMP-9、MRP1、P-gp、HRP 標記的羊抗兔IgG二抗 美國Sigma 公司。

DMIL LED 倒置熒光顯微鏡 德國徠卡公司；ELx800 全自動酶標儀 美國BioTek 公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統 美國BIO-RAD 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 香菇多糖的提取 準確稱取500 g 香菇，粉碎后過40 目篩，料液比1:60（g:mL）加水混勻，70 ℃超聲輔助提取2 h，提取2 次，過濾，減壓至250 mL，D101 大孔樹脂純化，蒸餾水洗脫，濃縮至250 mL，加入終濃度為 80%乙醇，靜置過夜，抽濾，溶解，二次醇沉，無水乙醇、丙酮沖洗，得香菇多糖。選擇葡萄糖為標準品，苯酚-硫酸法檢測多糖水平[16]。標準曲線方程為y=51.432x-0.0213（r=0.9998）。線性范圍0.00287～0.01762 mg/mL，純度為91.27%。溶于0.1%二甲基亞砜中，培養基稀釋；動物實驗進行時，采用PEG400 溶解，生理鹽水稀釋，4 ℃ 保存備用。

1.2.2 細胞培養 Capan-1 細胞培養于DMEM 培養基中，添加10%胎牛血清、100 單位/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素，37 ℃，5% CO2條件下標準加濕培養箱孵育。

1.2.3 MTT 法檢測細胞抑制率 選擇對數生長期的細胞（5×103個細胞/孔）轉移到96 孔板中，5% CO2培養箱中37 ℃孵育，貼壁后，加入終濃度分別為0、7.5、15、30、60、120、240 μg/mL 的LNT 的培養基溶液，空白對照組只加等量的培養基，另設置陽性對照組（60 μg/mL 順鉑，預實驗獲得）、0.1%的二甲亞砜（DMSO）組（對照組）、空白對照組（完全培養液）和只加培養基無細胞的空白組，每組設置3 個復孔，孵育48 h。每孔加入20 μL MTT 溶液。充分混合后，37 ℃孵育4 h，除去上清，加入150 μL 二甲亞砜溶液，37 ℃孵育30 min。隨后，通過酶標儀檢測490 nm 處的光密度（OD）值。抑制率（%）=（OD對照組-OD給藥組）×100/（OD對照組-OD空白組）。GraphPad Prism 8 統計軟件計算香菇多糖對Capan-1 細胞的IC50。

1.2.4 細胞分組及增殖率檢測 選取對數生長期胰腺癌細胞，隨機分組：對照組，正常培養；IL-6 組：IL-6 終濃度為50 ng/mL 的培養基培養[9]；IL-6+LNT 組：含50 ng/mL IL-6 和60 μg/mLLNT 的培養基培養。培養48 h 后，參照“1.2.3”采用MTT 法檢測增殖率，增殖率（%）=（OD給藥組-OD空白組）×100/（OD對照組-OD空白組）。

1.2.5 Western blot 檢測相關蛋白水平 參照“1.2.4”分組，孵育48 h，RIPA 細胞裂解液裂解細胞，BCA法測定總蛋白水平。使用10% SDS-PAGE 分離蛋白，并轉移到PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。膜與一抗孵育過夜：p-STAT3（1:1000）、STAT3（1:1000）、Notch1（1:2000）、Hes1（1:2000），TBST 洗滌三次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG （1:1000），37 ℃孵育1 h，TBST 洗滌三次，增強型化學發光試劑 （ECL）顯現蛋白條帶，Image J 軟件分析結果。

1.2.6 細胞遷移能力檢測 參照“1.2.4”分組，將Capan-1 細胞重懸于200 μL 無FBS 的培養基（1×105個細胞/孔）中，加入transwell 小室頂室。下腔添加10% FBS 的培養基。48 h 后，細胞固定染色，顯微鏡下隨機選取6 個區域計數細胞數量。

1.2.7 細胞順鉑耐藥模型的建立 對數生長期Capan-1 細胞置于處于含有0.1 μg/mL 順鉑（DDP）的培養基中培養2 周，調整DDP 濃度為0.2 μg/mL，繼續培養2 周，將DDP 濃度分別調整至0.4、0.8 μg/mL，選擇0.8 μg/mL DDP 存在下穩定生長的細胞被為抗DDP 的胰腺癌細胞Capan-1/DDP。

將Capan-1/DDP 細胞接種到96 孔板（5×103個細胞/孔），貼壁后分成3 組，包括對照組、IL-6、IL-6+LNT 組，每組加入DDP 終濃度分別為10、20、30、40 μg/mL 的培養基，孵育48 h，采用MTT 法檢測490 nm 處的OD 值，計算增殖率，GraphPad Prism 8 軟件計算順鉑半抑制濃度（IC50），Western blot 檢測Ki-67、MMP-9、MRP1 和P-gp 表達水平。

1.2.8 裸鼠急性毒性試驗 確定裸鼠最小劑量（Dm）和最大劑量（Dn），確定r值為0.7（r值代表相關系數）。設置LNT 劑量依次呈等比數列的5 個組別，每組10 只，各組裸鼠每天灌胃1 次，持續觀察14 d。應用SPSS 21.0 軟件中的Probit 模塊計算LD50。所有動物實驗均經校動物倫理委員會批準（批準號：2021-01011）。

1.2.9 動物模型建立及分組 0.2 mL 對數期Capan-1/DDP（1×107個/mL）細胞，接種于裸鼠側腹，當腫瘤達到50～100 mm3時，分為模型組（生理鹽水）、IL-6 組（5 μg/kg，預實驗確定）、順鉑+IL-6 組[順鉑（4 mg/kg，預實驗確定）+IL-6（5 μg/kg）]、IL-6+LNT組[LNT（80 mg /kg）+IL-6（5 μg/kg）]，每組8 只，均為腹腔給藥，1 次/3 d，每周用卡尺測量異種移植瘤的大小（計算體積=最短直徑2×最長直徑/2）。給藥21 d后，裸鼠給予安樂死，記錄腫瘤重量。Western blot檢測腫瘤組織中p- STAT3、STAT3、Notch1 和Hes1的水平。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 香菇多糖對胰腺癌細胞給藥濃度的篩選

研究表明，香菇多糖是香菇中活性成分之一，具有抗病毒、抗腫瘤、調節免疫功能和刺激干擾素形成的作用[17]。香菇多糖由于其廣譜的治療特性、相對較低的毒性和成本，成為潛在和理想的聯合化療的免疫調節有效活性成分[18]。與相同濃度的順鉑比較，60 μg/mL 的LNT 對胰腺癌Capan-1 細胞抑制率無統計學差異（P＞0.05），說明相同濃度的LNT 與順鉑存在相同的藥效。從圖1中可以看出，與對照組比較，7.5、15、30、60、120、240 μg/mL LNT 組胰腺癌Capan-1 細胞抑制率極顯著增加（P＜0.01）。通過GraphPad Prism 8 統計軟件計算香菇多糖對胰腺癌Capan-1 細胞的IC50值為73.34 μg/mL，后續香菇多糖依據預實驗濃度選擇60 μg/mL。

圖1 香菇多糖對Capan-1 細胞活力的影響Fig.1 Inhibitory effect of lentinan on Capan-1

2.2 LNT 對胰腺癌Capan-1 細胞增殖的影響

在腫瘤細胞中STAT3 激活與IL-6 和Notch 信號通路相關。高水平的IL-6 誘導STAT3 磷酸化，從而激活Notch 信號通路，促進細胞增殖。通過阻斷STAT3 磷酸化，低水平的STAT3 磷酸化能切斷IL-6和Notch 信號通路之家的聯系[19]。而Notch 信號通路對癌細胞的增殖具有一定的影響，對癌癥的進展發揮重要的作用[20]。同樣，在本研究中，與對照組比較，IL-6 組增殖率顯著上調（P＜0.05）（圖2），提示高水平的IL-6 通過激活STAT3/Notch 信號調控胰腺癌Capan-1 細胞增殖，而LNT 可以通過抑制IL-6/STAT3/Notch信號通路抑制Capan-1 細胞增殖。

圖2 LNT 對胰腺癌Capan-1 細胞增殖的影響Fig.2 LNT inhibited the proliferation of pancreatic cancer Capan-1 cells

2.3 香菇多糖對胰腺癌Capan-1 細胞中的 STAT3/Notch 信號通路的影響

已有研究表明，在部分癌細胞中，IL-6 通過STAT3 磷酸化激活Notch 信號通路，而Notch 信號通路可以促進腫瘤細胞的自我更新和增殖[21]。由圖3 可知，與對照組比較，IL-6 組p-STAT3/STAT3表達水平極顯著上調（P＜0.01），表明IL-6 可以促進STAT3 磷酸化，而p-STAT3 可以以二聚體的形式調控Notch1 及其下游Hes1 表達水平，而60 μg/mL LNT 可以逆轉IL-6 對STAT3/Notch 信號通路的影響。與IL-6 組比較，IL-6+LNT 組p-STAT3/STAT3、Notch1 和Hes1 表達水平顯著降低（P＜0.05），說明LNT 能夠通過靶向STAT3/Notch 信號通路對Capan-1 細胞產生影響。

圖3 LNT 對 STAT3/Notch 信號通路的影響Fig.3 Effect of LNT on STAT3/Notch signal pathway

2.4 LNT 對胰腺癌Capan-1 細胞遷移的影響

研究顯示，腫瘤微環境中的促炎因子IL-6 具有激活IL-6/STAT3 信號通路，促進癌癥發展的特征，包括癌細胞的遷移和侵襲[22-23]。本研究中，與對照組比較，細胞遷移率極顯著增加（P＜0.01）（圖4），說明IL-6 能刺激胰腺癌細胞遷移。而采用LNT 處理后，與IL-6 組比較，IL-6+LNT 組Capan-1 胰腺癌細胞遷移數目顯著減少（P＜0.05），表明LNT 可以逆轉IL-6通過STAT3 通路對Capan-1 胰腺癌細胞遷移的影響。

圖4 LNT 對胰腺癌Capan-1 細胞遷移的影響Fig.4 LNTinhibits the migration of pancreatic cancer Capan-1 cells

2.5 LNT 對胰腺癌Capan-1 對順鉑耐藥的影響

本研究中，伴隨順鉑濃度的增加，對照組、IL-6 組以及IL-6+LNT 組Capan-1/DDP 細胞增殖率（極）顯著下調（P＜0.05，P＜0.01）（圖5），說明10～40 μg/mL的順鉑能有效抑制Capan-1/DDP 細胞增殖，并顯示明顯的濃度梯度依賴性。通過IC50值比較發現，與對照組比較，IL-6 組順鉑對Capan-1/DDP 細胞的IC50值極顯著增加（P＜0.01），說明IL-6 能促進Capan-1/DDP 細胞的耐藥性，這與相關報道一致[24]，因為IL-6 作為一種炎癥相關的腫瘤細胞因子，能通過激活IL-6/STAT3 信號通路，激活下游一系列因子，導致癌細胞增殖、耐藥、侵襲和轉移等惡性行為的發生[25]。而采用LNT 處理后，與IL-6 組比較，IL-6+LNT 組順鉑對Capan-1/DDP 細胞的IC50值呈現極顯著下調（P＜0.01），胰腺癌細胞耐藥明顯逆轉，說明LNT 可能對治療胰腺癌以及降低耐藥性具有一定的調控潛力。

圖5 LNT 抑制胰腺癌Capan-1 對順鉑耐藥的影響Fig.5 Effect ofLNT inhibits cisplatin resistance in pancreatic cancer Capan-1

2.6 LNT 抑制胰腺癌Capan-1 中 Ki-67、MMP-9、Pgp 和 MRP1 的表達

Ki-67 在細胞周期的G1、S、G2 和M 階段保持活性，為細胞增殖的標記物，而MMP-9 是基質金屬蛋白酶最復雜的形式之一，具有降解細胞外基質（ECM）成分的能力，同樣MRP1 的表達與癌細胞耐藥有關，并激活多藥耐藥家族的有效成員p -糖蛋白（P-gp）的表達[26-28]。本研究中，與對照組比較，Ki-67、MMP-9、MRP1 和 P-gp 表達水平（極）顯著上調（P＜0.05，P＜0.01）（圖6），說明IL-6 能通過Ki-67、MMP-9 蛋白的表達促進胰腺癌細胞增值和遷移，并加強其耐藥性。而采用LNT 處理后，與IL-6 組比較，IL-6+LNT 組Ki-67、MMP-9、MRP1 和 P-gp 表達水平顯著降低（P＜0.05），進一步驗證了LNT 抑制Capan-1 增值、遷移和耐藥的原因，同時也間接說明IL-6 可能通過STAT3/Notch 通路調節Capan-1 胰腺癌細胞增殖、遷移和耐藥。

圖6 IL-6 對 Ki-67、MMP-9、P-gp 和 MRP1 表達的影響Fig.6 Effect of IL-6 on the expression of Ki-67, MMP-9, P-gp and MRP1

2.7 LNT 對裸鼠急性毒性試驗

本實驗最大給藥量為6000 mg/kg，灌胃后，出現發抖、怕冷，扎堆，半小時后恢復正常，無死亡發生，根據外源化學物相對毒性分級標準，一次經口LD50在5000 mg/kg 以上為無毒，因此實際香菇多糖無毒。按照預實驗最終取劑量為80 mg/kg。

2.8 LNT 對胰腺癌移植瘤順鉑耐藥的影響

由圖7 可知，本研究中，與模型組比較，IL-6 組瘤體體積、瘤重（極）顯著上調（P＜0.05，P＜0.01），說明IL-6 促進了腫瘤的增殖；而與IL-6 組比較，IL-6+LNT 組瘤體體積、瘤重極顯著下調（P＜0.01），說明LNT 可以發揮抑制IL-6 致瘤作用，下調瘤重水平。這與相關研究一致[29]，LNT 是從香菇中分離出來的β-（1,3）-葡聚糖多糖，已知具有低毒性和抗腫瘤活性，并有可能通過增強宿主的免疫能力、降低炎癥水平間接發揮抗腫瘤作用[30]。

圖7 LNT 對胰腺癌移植瘤順鉑耐藥的影響Fig.7 Effect of L-6 on cisplatin resistance in pancreatic cancer xenografts

2.9 IL-6 對胰腺癌移植瘤 STAT3/Notch 信號通路的作用

在這項研究中，與對照組比較，IL-6 組Notch1、Hes1 表達水平極顯著上調（P＜0.01）（圖8），證明了IL-6 靶向Notch 信號后，能導致腫瘤細胞中STAT3出現過度激活，并進一步對Notch1、Hes1 產生影響。而LNT 和順鉑處理后，與IL-6 組比較，IL-6+LNT 組p-STAT3/STAT3、Notch1、Hes1 表達水平（極）顯著下調（P＜0.05，P＜0.01），說明LNT 和順鉑能下調IL-6 對致瘤性的影響。

圖8 IL-6 對胰腺癌移植瘤 STAT3/Notch 信號通路的作用Fig.8 Effect of IL-6 on STA T3/Notch signal pathway in pancreatic cancer xenografts

3 結論

本實驗旨在研究LNT 對人胰腺癌的直接抗腫瘤作用及其對化療敏感性的影響，并分析體內外機制。本研究中7.5～240 μg/mL 香菇多糖顯著（P＜0.05）抑制胰腺癌Capan-1 細胞增值和遷移，下調p-STAT3/STAT3、Notch1 和Hes1 表 達 水 平，說 明LNT 香菇多糖能通過調控IL-6/STAT3/Notch 信號通路影響Capan-1 的增殖和遷移。針對Capan-1/DDP 耐藥株結果表明，LNT 能下調其對順鉑的IC50，說明LNT增強了Capan-1/DDP 對順鉑的耐藥敏感性。此外，通過體內實驗表明，LNT 能下調瘤體體積、瘤重，降低p-STAT3/STAT3、Notch1、Hes1表達水平，這些結果都表明LNT 能有效抑制IL-6/STAT3/Notch 信號通路，抑制癌細胞增殖，增加耐藥敏感性。本研究通過體內外實驗闡明了LNT 抗胰腺癌的基本機制，為LNT 作為一種輔助抗癌藥提供了新的認識，為胰腺癌的發生機制、臨床治療提供參考，同時也為香菇多糖的進一步開發提供依據。